Методи, що використовуються для підвищення селективності ПППР датчика біомолекул

Було б бажано мати прилад, де з розчину біоматеріалу на шар молекул-рецепторів осаджується лише чітко визначений сорт молекул. Для детектування тих чи інших органічних молекул, як правило, використвують спеціальні захисні шари на поверхні металічної плівки та біоспецифічні реакції. Так, коротко, схема експерименту із детектування барбітурової кислоти в суміші з вероналом (близька за хім. властивостями сполука) виглядає наступним чином. Існує Y-тіобарбітурова кислота, що добре реагує з барбітуровою кислотою, але не реагує із вероналом. Вона містить сірку. Це дозволяє осаджувати її на поверхню золотої плівки поруч із X-додекантіолом, але при цьому реакція на поверхні плівки відбуватиметься лише із барбітуровою кислотою. Або інша можливість: великі органічні молекули часто взаємодіють лише попарно (через центри взаємодії, розташування яких для кожної молекули специфічне і унікальне). Біоспецифічна взаємодія — це утворення спеціального типу хімічних зв’язків між парами біомолекул типу «ген-антиген». Через них виникає проблема іммобіліцазії одного з компонентів біоспецифічної взаємодії на поверхні ПППР-перетворювача. Наприклад, трипсин та соєвий інгібітор трипсину (СІТ) складають таку пару. Тепер спочатку адсорбуємо СІТ на поверхню золотої плівки, модифікованої сульфідом й змиємо буфером всякі залишки. Далі додамо трипсин: буде сходинка на сенсограмі. Змиємо буфером трипсин, додамо його знов: маємо таку саму сходинку, тобто наявна біоспецифічна взаємодія.

Далі майже те саме, але з купою хімії.

Органічну моношарову матрицю для селективної адсорбції барбітурової кислоти (C₄H₄O₃N₂) на золотій поверхні ППР перетворювача отримують самовідтворюваною соадсорбцією суміші молекул додекантіолу та тиобарбітурової кислоти C₄H₄O₂N₂S. Виготовлена матриця з високим ступенем селективності зв'язувала з водного розчину молекули барбітурової кислоти, тоді як зв'язування на матриці (а значить і розпізнавання близького структурного аналога цієї речовини – барбітала (веронала- C₈H₁₂O₃N₂) не відбувалося, що демонструє сенсограма (тут не наведено).

Необхідно підкреслити, що при наномолекулярній архітектурі покриття з самоорганізацією особливу роль відіграє якість структури підкладинки, оскільки будь-які викривлення форми матриці меркаптанів призводять до порушення або повної відсутності селективної взаємодії з дослідною речовиною.

Іншим прикладом впливу попередньої обробки робочої поверхні золотої плівки ППР перетворювача є утворення на золотій поверхні нерозчинного сульфіду золота – Au_xS_y. Утворення такого шару відбувається при термічному відпалі плівки в парах сірководню (H₂S). При чому, спочатку на поверхні золота утворюється розсереджена фаза сітки, яка з часом трансформується в щильноупакований шар сульфіда Au_xS_y з одночасною реконструкцією поверхні.

Ефект ППР дає альтернативу традиційним біохімічним методам аналізу так званих специфічних взаємодій, таких як от розпізнавання антигенів – чужорідних речовин (вірусів, бактерій, отрут, і т.д.) молекулами антитіл – імуноглобулінів, які виробляються живими організмами для розпізнавання і знешкодження цих шкідливих речовин. Специфічна взаємодія полягає виключно в селективному зв'язуванні компліментарних ділянок двох молекул. Зазвичай це зв'язування включає в себе притягання за допомогою гідрофобних силі виникнення декількох, деяким чином розташованих водневих зв'язків між двома молекулами. Таким чином, якщо одну молекулу компліментарної пари закріпити на робочий поверхні ППР перетворювача, то відповідна молекула (якщо така є присутньою в розчині) може утворювати з поверхнею досить тривкий зв'язок. Утворення такого додаткового молекулярного покриття можна розглядати як утворення деякого діелектричного шару, що повинно призводити до збільшення кута плазмонного резонансу.

Така обробка необхідна для підвищення ступеню інертності металевої плівки при дослідженні взаємодії білків-інгібіторів з ферментами. Як відомо, така взаємодія базується на високому ступені компліментарності реагуючих поверхонь молекул, що забезпечує велику кількість взаємодій через водневі зв'язки та гідрофобні контакти. І важливою вимогою до робочої поверхні ППР перетворювача є відсутність деструктивної дії по відношенню до біологічно активних молекул, тобто, при адсорбції білок повинен залишатися в нативному стані, щоб його здатність до специфічного зв'язування не пропадала.

Розглянемо це на прикладі взаємодії пари “соєвий інгібітор трипсину-трипсин” (молекулярна маса 23000 і розміром комплексу ~ 2nm). При цьому соєвий інгібітор трипсину (СІТ) є високомолекулярною сполукою з молекулярною масою 21500 і розміром молекули ~ 2nm.

На Рис.3 показано величину зсуву резонансного кута ППР (у стані насичення) для адсорбції СІТ і послідуючою взаємодією з ним трипсина на необроблену та експоновану з різним часом в атмосфері сірководню поверхні золота. З цього рисунка видно. що взаємодія СІТ з поверхнею (і як результат СІТ з трипсином) відбувається по різному в залежності від тривалості по-передньої сульфата-ції золотої плівки. Так, при тривалості обробки менші за 15 годин, специфічна взаємодія трипсина з СІТ майже не відбувається (швидше за все білок на не досить інертній поверхні денатурується) тут кількість зв'язаного трипсина складає ~ 20-30% від адсорбованої кількості СІТ. А при великих тривалістях сульфатації золота інертність робочої поверхні різко зростає і майже весь білок, що адсорбується на поверхню золота залишається в нативному стані. Ефективність утворення комплексу фермент-інгібітор становить майже 100 відсотків – весь трипсин зв'язується з білком-інгібітором.

Дата добавления: 2015-01-03