Упаковочная система фага лямбда и её практическое применение

Модель.

Здесь уместно остановится на терминазной реакции и на тех фактах, которые объясняют процесс упаковки фаговой ДНК фага λ в формирующуюся головку. Схема организации cos-сайтов и участия некоторых генов в процессе упаковки и структура, именуемая порталом фага λ, которыми соединяет головку с хвостовым отростком и участвует в упаковке ДНК.

Терминация детерминируется 2-мя генами: ген Nu1 и А. Первый ген детерминирует малую субъединицу терминазы, второй- большую. Ген В детерминирует структуру белка-портала, ген Q участвует в детерминации структур необходимых для процесса соединения головки с хвостом, детерминирует структуру акцепторных или дополнительных белков. Ген С представляет собой компонент капсида, вовлекаемый в образование коннектора-- структур соединяющий головку с хвостом.

Cos-сайт представляет собой тройственную структуру и состоит из cos-Q, cos-N и cos-B. – Cos-Q – последовательность необходимая для терминации процесса упаковки, cos-N – сайт, где осуществляется никирование конкотемерной ДНК в области кос-сайта, ступенчато-обратный разрез с образованием липких концов на окончаниях молекулы геномной ДНК. Сos-B сайт подразделяется на несколько областей именуемых R1, R2, R3, которые являются сайтами связывания с малой субъединицы терминазы, а область I1- для взаимодействия с фактором интеграции клетки-хозяина, который необходим в процессах лизогенизации.

Каким образом осуществляется терминазная реакция? Терминатор соединяется со случайно встречаюцимся cos-сайтом и вводит ступенчатообразные разрезы, обозначаемые N1 и N2, при этом формируются концы геномных ДНК фага λ: левый и правый конецы. Терминатор соединяется с левым концом выступающего конкотемера и формируется временный комплекс – комплекс1, состоящий из теминазы и фаговой ДНК. Этот комплекс приводит к образованию тройственного комплекса, более стабильного, состоящего уже из предголовки, терминазы и упаковывающейся ДНК. При этом левый конец, отрезанный уже от конкотемера, проникает в предголовку и с участием естественно, гидролиза АТФ для высвобождения свободной энергии необходимой для осуществления этого процесса, до следующего сos-сайта.

Когда поступает к терминазе следующий cos-сайт, возникает новый разрез и первый геном упаковывается в предголовку, а терминаза оказывается соединенной с левым концом следующего геномного фрагмента. В таком состоянии она опять же может обеспечивать формирование первого комплекса терминазой ДНК фага, который потом трансфомируется во второй комплекс с предголовкой очередной уже, и таким образом один фермент может обеспечивать упаковку 3х геномов, формир-ся в фаговых частицах.

Портал из 12 белков детерминиреумых геном В, формируется кольцевая структура в центре которой имеется полость для прохождения 2-нитевой ДНК фага λ для упаковки

Применение.

Создание космид на основе фага лямбда. Такие векторы способны включать в свой состав до 40 т.п.н. и при этом активно амплифицироваться в кишечной палочке. Пример – космида pLFR-5. Размер приблизительно 6 т.п.н. Имеет 2 кос-сайта фага лямбда, разделённых сайтом рестрикции, полилинкер с шестью уникальными сайтами рестрикции, точку ori и ген устойчивости к тетрациклину. Космида может интегрировать чужеродную ДНК до 40 т.п.н. Препараты ДНК смешивают и подвергают лигированию. Те продукты лигирования, которые имеют вставку длиной 40 т.п.н имеют суммарный размер близкий к 50 т.п.н, могут упаковываться in vitro в головки фага λ. Реассоциировавшие молекулы pLFR-5 не содержащие вставок, упакованы не будут. После сборки фаговых частиц, ими инфицируют E. Coli. Оказавшись в молекуле линейная молекула pLFR-5 замыкается в кольцо благодаря наличию кос-сайтов. В таком виде она может долго существовать и реплицироваться.

Дата добавления: 2014-12-24