Формирование ДНК-интермедиата ретровирусов и механизм его интеграции с хромосомой клетки-хозяина

Доказательства существования стадии ДНК-интермедиата в цикле репродукции ретровирусов.

В лаборатории Темина было поcтулировано что вирус Рауса репродуцируется проходя видимо стадию ДНК- интермедиата, но по поскольку геном вируса представлен РНК, то этот ДНК- интермедиат должен синтезироваться с использованием матрицы РНК с образованием продукта ДНК.

В 60-х гг. провели эксперимент с антибиотиком актиномицином Д (способен ингибировать синтез РНК на матрице ДНК, но не блокирует синтез РНК на матрице РНК).

3 случая (на среде с актиномицином Д): л.11.рис.(4)

1. норм. к-ки =>останавливался синтез РНК.

2. клетка с РНК вирусом => вирусная РНК синтезируется, а клеточная нет.

3. клетка с вирусом саркомы Рауса = > блокируется весь синтез.

Предположили, что вирус саркомы Рауса проходит промежуточную стадию синтеза ДНК, с которой идёт синтез РНК, который потом и блокируется.

Провели ещё один эксперимент, который доказывал это предположение: л.11.рис.(6)

1. первая чашка – контроль, к клеткам находящимся в стационарой фазе добавляли сыворотку, и клетки нормально росли.

2. нормальные клетки, находящиеся в стационарной фазе заражали вирусом саркомы Рауса. При добавлении в среду сыворотки, клетки трансформировались и продуцировали вирусные частицы.

3. нормальные клетки, находящиеся в стационарной фазе заражали вирусом саркомы Рауса и ещё добавляли ингибитор синтеза ДНК. Вирус не продуцировался. Если удалить ингибитор и в среду добавить сыворотку, то…….

Вирион ретровируса состоит из нуклеиновой кислоты и белка. В качестве нуклеинового компонента выступают 2 молекулы «+» - РНК. Вирионы содержат несколько молекул тРНК, которые выполняют функцию праймера при синтезе вирусной ДНК интермедиата: за счет водородных связей ассоциируются с «+» - РНК, а свободный 3′-конец служит затравочной точкой.

Этапы репродукции ретровирусов:

Репродукция начинается с ассоциации комплекса молекулы тРНК, фермента обратной транскриптазы и геномной РНК.

Синтез однонитевой копии ДНК на РНК-матрице обеспечиваемые обратным транскриптом, синтезируются однонитевые ДНК, которые находятся во временной ассоциации за счет водородных связей с матричной молекулой геномной нити РНК вируса(+ нить)

Следующий этап- деградация нити РНК из этого гибридного комплекса РНК-ДНК, за счет РНКазной активности фермента обратной транскриптазы, причем эта РНКазная активность реализуется только в отношении гибрида ДНК-РНК (когда одна нить представлении ДНК, другая РНК) и съедается только РНК. На другие свободные РНК этот фермент не действует. Затем, после дегдарадации РНК-нити, на синтезированной нити ДНК достраиваются комплементарная нить ДНК, за счет чего формируется двунитевый продукт- дикция обратной транскриптазы- двунитевая молекула ДНК, представляющая собой копию вирусного генома(+РНК), причем эта двунитевая молекула замыкается в кольцо и этот весь процесс осуществляется в цитоплазме; затем эта кольцевая молекула ДНК, то бишь вирусный ДНК-интермедиат, транслоцируется в клеточное ядро, где встраиваются в геном клетки хозяина в неопределенных неспецифических местах. Это говорит о том, что для встраивания данной ДНК не требуется обширная генетическая гомология, достаточно несколько пар гомологичных нуклеотидов, чтобы произошел одиночный кроссинговер и кольцевая молекула-интермедиат вирусной ДНК встроится в хромосому клетки. (Лекция 11 рис 24-28(1-3) 24-29)

Дата добавления: 2014-12-24