Открытие обратной транскриптазы и характеристика этого фермента

На основании всех полученных фактов которые были получены в ряде экспериментов в лаборатории Темина было постулировано что вирус Рауса репродуцируется проходя видимо стадию ДНК- интермедиата, но постольку поскольку геном вируса представлен РНК, то этот ДНК- интермедиат должен синтезироваться с использованием матрицы РНК с образованием продукта ДНК. Так как в клетке этого фермента нет как такового, то возник вопрос, что данный фермент должен находиться в составе вирусной частицы и привноситься в клетку в процессе заражения ее данным вирусом. Основанием для такого предположения были два факта. Один был получен Цотоши Мицутами, который заразил клетки фибробласта цыпленка и блокировал синтез белка. Несмотря на то, что синтез белка был блокирован в клетках, вирус Рауса репродуцировался. Это говорило о том что для репродукции данного вируса на первых стадиях репликации его генетического материала не требовался синтез какого- то фермента ибо синтез белка был блокирован. Значит, этот фермент находился в составе вирусной частицы. Ну и вторым фактом позволяющим предположить это было уже в 1967 году обнаружение в составе вириона ферментов в частности РНК-полимеразы в вирусе оспы поп-вирусе и репликазы РНК-содержащих вирусов ферментов, с которыми ассоциируются их геномы. Но для этого нужно было выделить этот фермент и доказать что он находится в составе вирусных частиц. Было предпринято несколько экспериментов в нескольких аранжировках и четко установлено что, да в вирусных частицах имеется фермент, который впоследствии и был назван обратная транскриптаза.

Экспиримент сводился к следующему(какой год, автор и что этим экспериментом можно доказать?): вирус саркомы Рауса подвергался обработке детергентами с целью разрушения поверхностных структур (оболочек вирусов), но это разрушение не было полным разрушением. Частично депротеинизированный вирус вносился в пробирку в которую добавлялись 4 дезоксирибонуклеотида, активированные дезоксинуклеотидтрифосфаты один из которых был мечен радиоктивным изотопом в присутствии магния ну т.д. и т.п. и инкубировалось при 40 С. В результате в процессе инкубации образовывался кислотнонерастворимый продукт (кислотнонерастворимая фракция), что являлось показателем на ДНК. Она была устойчива к щелочам и к РНК-азе, но разрушалась под действием ДНК-азы. Таким образом, было продемонстрировано, что в данных условиях на РНК-матрице, которая содержится в полуразрушенных вирионах, синтнзируется за счет имеющихся ферментов в составе вириона, продукт - двунитевая ДНК. При повторении такого же экспиримента, но с добавлением исходных...РНК-азы с последующим внесением дезокситрифосфата никакой кислотнонерастворимой фракции не образовывалось. Таким образом, был сделан вывод, что для образования такого продукта необходима РНК-матрица. (Рис 0001 лек 12)

В последующем эксперименте было доказано, что данный продукт синтезируемый под действием РНК – зависимой ДНК- полимеразы формируется комлементарную матричной РНК молекулу ДНК. Меченые ДНК полученные в результате полимеразной реакции осуществляемой РНК-зависимой ДНК-полимеразой подвергают денатурации и смешивали с немеченой, ну в эти меченые молекулы добавлялась метка и немеченой РНК полученной из вириона т. е геномной РНК данного вируса. При отжиге формировались двунитевые гибридные молекулы, которые идентифицировались путем равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия. Идентифицировались гибридные молекулы молекулы по той полосе в которой они занимали представители метки в двунитевой ДНК и однонитевой РНК. Таким образом, было продемонстрировано, что в вирионах содержится фермент, который обеспечивает данную реакцию. (Рис0002 лек12)

В 70- ом году в Хъюстоне на противораковом конгрессе было сделано сообщение о данных результатах и Темину стало известно, что подобного вида эксперименты, но с другим вирусом, вирусом миеломы, были проведены в лаборатории Балтимора. А в июне, через месяц,в журнале Nature появились две статьи одна из лаборатории Темина, а другая из лаборатории Балтимора о том, что обнаружен такой фермент, и фермент редакция обозвала обратной транскриптазой. Хотя Темин был против такого названия он предпочитал называть –фермент синтеза ДНК управляемой РНК, но этот термин прижился и до сих пор широко употребляется в научной литературе. Хотя предлагались и другие термины, например известный биохимик Кенгергаф предложил название данного фермента ревертаза (процесс обратной транскрипции, но этот термин не прижился). Обнаружение данного фермента привело к тому, что товарищ Крик был не прав, формулируя где-то в 61 году центральную догму молекулярной биологии: в клетке и вообще в природе поток генетической информации осуществляется от ДНК к РНК и от РНК к белку. И возражением было то, что в некоторых случаях поток информации осуществляется от РНК к ДНК. И это рассматривалось как крушение центральной догмы молекулярной биологии. Но товарищ Крик оказался хитрее, чем его оппоненты и сказал, что это лишь уточняет центральную догму: поток генетической информации идет от НК к белкам и никогда белков к НК. Но такое явление имеет место не во всех биологических системах, а только у определенных вирусов, хотя Темин пытался найти обратную-транскриптазу и в нормальных клетках, не инфицированных вирусом. И оказалось, что такой фермент бывает в клетках особенно в зародышевых клетках на ранних стадиях развития организма. И согласно его концепции данный ферменл играет огромную роль в амплификации определенных генов при дифференциации клеток ибо иРНК, которая снимается с каких- то генов обратной-транскриптазой синтезирует копии этих генов и эти гены могут встраиваться в хромосомы таким образом амплифицируя число этих генов что необходимо для стадий дифференциации. Во всяком случае, много еще не известно о роли обратных транскриптаз в биологических системах.

Характеристика обратной транскриптазы.

Обратная транскриптаза сталкивается с необходимостью копирования двунитевой ДНК с однонитевой РНК. При формировании ДНК-интермедиата обратная транскриптаза дважды меняет матрицу, тем самым обеспечивая два «прыжка». Обратная транскриптаза должна:

1. Обеспечивать РНК-зависимый синтез ДНК

2. Осуществлять деградацию РНК, находящуюся в составе гибрида РНК-ДНК

3. Осуществлять ДНК-зависимый синтез ДНК

4. Обладать способностью специфически разрезать ДНК с 5 ^' -конца у последовательности левого участка U3.

Дата добавления: 2014-12-24