Фазмиды, космиды и фагмиды

Вектор, созданный с использованием определенных компонентов фагового генома является очень удобным вектором, который используется с упаковочной системой фага λ, но создан он на основе плазмиды, в которую встроен очень короткий фрагмент фагового генома, содержащий cos-сайты. Емкость фагового вектора ограничена. В него можно вставить только такой фрагмент, который не приведет к увеличению этой химерной молекулы более 105% генома, т.е. емкость фагового вектора не очень высока.

В плазмиду можно вставить, значит, больше ДНК, ибо плазмида небольшая молекула, намного меньше, чем геном фага λ. И вот если в такую плазмиду, содержащую в своем составе cos- сайт, вставить фрагмент ДНК, то получатся химерные молекулы, имеющие cos- сайты и эти химерные молекулы можно запихнуть в упаковачную систему фага λ и упаковать в головку фага, но уже не фаговый геном, а фрагмент содержащий репликатор плазмиды, соответствующий ген, по которому отбирается потом клетки и клонирующий фрагмент. Такие векторы называются космиды. Небольшая молекула плазмиды, в которой имеется соответствующие сайты для рестрикции, несет гены резистентности небольшой фрагмент фагового генома, содержащий cos-сайт. По этому сайту рестрикции можно вставить в эту плазмиду тот или иной по размерам фрагмент чуж.ДНК. Затем, используя, систему упаковки фага λ (система упаковки in vitro) можно получать трансдуцирующие фаги в которых будет содержаться химерная молекула ДНК. Космида подвергается рестрикции, получаются линейные молекулы из кольцевой плазмиды, так сказать линиализированные плазмидные ДНК. Чуж.ДНК режется этой же самой рестриктазой с образованием липких концов подходящим этим липким концам.

Смешивается, отжиг, ДНК-лигаза и в этой смеси появляется и то, что нужно и то что не нужно. Могут конечно замыкаться в кольцо космиды, могут замыкаться в кольцо фрагменты чужДНК и формироваться конкатемеры. И в этом случае, когда между cos- сайтами оказывается заключенная ДНК размером 47 kb (т.п.н.), то вот такая штука в упаковачной системе может быть упакована в белковую оболочку фага. Возникают трансдуцирующие фаговые частицы. Они заражают клетку, в клетку проникает космида, в этой клетке чужДНК воспроизводится в составе космиды. Космиды имеют репликон(реплекатор) и она реплицируется как плазмида. Получается клон клеток содержащих клонирующую плазмиду. Емкость космиды превышает емкость фагового вектора. Можно вставить больший размер, чем молекула чужДНК в составе фагового вектора. Из фаговых генов здесь ничего нет, есть небольшие части плазмиды и встроенная чужДНК.

Есть другая векторная система – фазмиды. Там есть фаговые гены определяющие репродукцию фага и плазмидные гены, определяющие продукцию и репликацию как плазмиды. Космиды не являются вектором созданным на базе фага λ. Фазмиды созданы на базе фага, потому что там в основном фаговая система для репликации. Но к этой фаговой системе репликации добавлен еще репликатор плазмиды и поэтому называется фазмида. По сути дела фазмида представляет собой фаговый вектор в который вставлена от небольшой плазмиды область содержащая репликатор. И эта структура может реплицироваться как в геном фага (контроль фаговых генов отвечающих за репликацию) и может реплицироваться как плазмида под контролем репликатора этой плазмиды. В этом фаговом векторе имеется мутация в гене С1 (мутация термочуствительности), то есть этот ген детерминирует термочувствительный репрессор. При низких температурах этот репрессор активен, если t⁰ высокая, то репрессор инактивируется. Режется векторная система, удаляется часть внутри, вставляется соответствующих размеров чужДНК, формируется полноценных размеров структура с липкими концами. Эти структуры добавляются к упаковачной системе и формируются в этой системе трансдуцирующие фаги. В качестве генома этих трансдуцирующих фагов – фаговые гены и плазмидные гены. Может в одних условиях функционировать репликатор фага, в других условиях репликатор плазмиды. При 32⁰ С, если попадает такая структура в клетку, репрессор фага λ активен и данная химерная ДНК будет реплицироваться под контролем репликатора плазмиды. Ибо репрессор подавляет активность генов фага учавствующего в репликации. В бактериальных клетках эта структура реплицируется как плазмида. Получается клон клеток, каждая из которых содержит вот эту фазмиду и таким образом в таких бактериальных клетках содержится клонированный ген. Если после заражения этими трансдуцирующими фагами появляются клетки и рост их поддерживается при температуре 42⁰ С, то термочувствительный репрессор фага инактивируется и включаются фаговые гены. Репрессор на фаговые гены не действует, и тогда эта временная структура реплицируется как фаг. Упаковывается в фаговые оболочки и получается шток фагов, каждая частица несет клонированный сегмент. В данном случае получается клон бактериальных клеток, в данном случае получается клон фагов(шток фагов). Так что эта емкость данного вектора приближается к емкости фагового вектора. Но удобства данного вектора заключается в том, что можно получить в виде штаммов клеток клон данного гена, или в виде штаммов фаговых частиц(можно далее заниматься разными манипуляциями при клонировании генов и т.д.).

Создан еще один вид фагового вектора – фагмиды. Представляют собой фаговые векторы. Они созданы на основе плазмид, в которые встроен репликатор фагов содержащий 1 нить ДНК. И если такой плазмидой, содержащей репликатор фага, содержащего нитевидную ДНК, ввести в бактериальную клетку и одновременно заразить интактную фагом F1,то данная плазмида (фагмида) будет реплицироваться по типу фаговой репликации и включаться в белковую оболочку,которая возникает за счет репродукции вот этого интактного фага,фага помощника. И на ряду с образованием нормальных фаговых частиц F1 будут формироваться фаговые частицы содержащие однонитевую плазмидную ДНК. Таким образом фагмиды позволяют получать однонитевые ДНК содержащие сегмент чужДНК. Это удобно для создания так называемых меченных зондов. Но можно получить и в виде двунитевых молекул, тогда надо получить однонитевую молекулу из этих фагов in vitro,с помощью достройки комплемментарной 2-ой нити. Так что, фагмиды позволяют получать гибридные ДНК в виде однонитевой и двунитевой ДНК, но с использованием системы синтеза белка in vitro.

Дата добавления: 2014-12-24