Векторы на основе вирусов животных

Векторы на основе вирусов животных (ретровирусов, полиомавирусов) и их использование в генотерапии.

Ретровирусные векторы

Опыт клинических испытаний с участием более 200 пациентов показывает, что дефектные по репликации ретровирусные векторы не оказывают каких-либо неблагоприятных побочных эффектов. Тем не менее безопасности их применения продолжают придавать большое значение. Создана конструкция, называемая плазмовирусом, которая содержит ретровирусные гены gag и poh на­ходящиеся под контролем 5'-LTR-npoMOTopa, a также «терапевтический» ген и ген env, управляемые цитомегаловирусным промотором. После трансфекции плазмовирус запускает образование дефектных по репликации вирусных частиц, причем вероятность рекомбинации с образованием компетентных по репликации ретровирусов очень мала. Вектор может переносить не более 3,5 т. п. н. ДНК, но и длина большинства потенциальных «терапевтических» кДНК и генов — супрессоров опухолей составляет 0,5—2 т. п. н.

В ретровирусную векторную систему внесены дополнительные усовершенствования: увеличено число образующихся вирусных частиц, повышена эффективность трансдукции, осуществлена генноинженерная модификация, обеспечивающая их проникновение в неделяшиеся клетки, повышена специфичность инфекции. В последнем случае геном рекомбинантного ретровирусного вектора упаковывается в оболочку другого вируса, белок которой и определяет специфичность связывания ретровируса и спектр инфицируемых им клеток. Это явление называется фенотипическим смешиванием (pseudotype formation). Фенотипически смешанный вирус получают с помощью котрансфекции клеточной линии, которая синтезирует продукты генов gag и pol, рекомбинантным ретровирусным вектором и вектором, экспрессирующим ген env другого вируса. Изменяя ген env, можно как сузить спектр инфицируемых вирусом клеток до строго определенного типа, так и расширить его. Кроме того, в ген env ретровируса можно встроить нуклеотидную последовательность, кодирую­щую пептид, который связывается с определенным клеточным рецептором и обеспечивает внедрение рекомбинантного ретровируса в нужные клетки. И наконец, можно добиться специ­фичности экспрессии терапевтического гена, осуществляя ее под контролем промотора, специфичного для определенных клеток.

Аденовирусные векторы

Аденовирусы инфицируют неделящиеся клетки человека и широко используются в качестве жи­вых вакцин, которые предотвращают респираторные инфекции и гастроэнтериты, не оказывая побочного действия. Эти свойства делают аденовирусы перспективными для доставки генов в клетки-мишени.

Для получения аденовирусного вектора провели котрансфекцию клеточной линии, синте­зирующей продукты аденовирусного гена Е1, двумя участками генома аденовируса (рис. 21.7). Один из них может существовать в виде гатазмиды в Е. coli и содержит вместо Е1 -области «тера­певтический» ген, фланкируемый нуклеотидными последовательностями аденовируса, а второй представляет собой молекулу ДНК аденовируса, которая лишена 5'-концевого участка, включающего El-область, и имеет перекрывающийся уча­сток с несущей терапевтический ген плазмидой. Рекомбинация между двумя трансфицирующими фрагментами ДНК в области их перекрывания приводит к восстановлению полноразмерного аденовирусного гена, в котором вместо Е1-области находится терапевтический ген. Продукты гена Е1, поставляемые клеткой-хозяином, инициируют образование вирусных частиц, высвобождающихся из клетки в результате лизиса. В отсутствие рекомбинации трансфицирующие молекулы ДНК, обладающие недостаточной длиной, не могут упаковываться в вирусные частицы. Вероятность того, что между областью Е1 в геноме клетки-хозяина и ДНК рекомбинантного аденовируса произойдет рекомбинация с образованием компетентных по репликации вирусов, чрезвычайно мала.

После того как рекомбинантный аденовирус инфицирует клетку-мишень, его ДНК проникает в ядро, где и происходит экспрессия «терапевтического» гена. Рекомбинантная ДНК не интегрирует в хромосому и сохраняется непродолжительное время, поэтому при проведении генотерапии с использованием аденовирусных векторов необходимо вводить их с определенной периодичностью.

Аденовирусные векторы использовали в клинических испытаниях по генной терапии муковис-цидоза.

Т к у эукариот (животных) не обнаружено ядерных плазмид, то единственными «донорами» для переноса векторов могут быть вирусы. Вирусы животных плохи для использования потому что:

1. В их геноме нету несущественных областей, которые можно было бы заменить клонированной ДНК. => векторы сконструированные на базе таких вирусов дефектны.

2. Емкость вирусных векторов ограничена, т к в капсид может упаковываться лишь определённое кол-во ДНК(а гены эукариот очень большие 30 и > пар нуклеотидов).

Вирус SV-40.

Развиваются в клетках обезьяны. Т к он обладает онкотрансформирующим действием и может нарушить структуру генов, его редко используют для интеграции клонированных генов в клеточные хромосомы. С помощью таких векторов можно наблюдать экспрессию.

Вирус осповакцины.

Обладает двунитевой ДНК, которая имеет уникальное строение. Это линейная молекула на обоих концах которой имеются шпильки, замыкающие ковалентно обе нити ДНК. Привлекателен в качестве вектора, т к:

1. широкий спектр клеток-хозяев. От беспозвоночных до позвоночных.

2. Позволяет внедрять большие фрагменты чужеродной ДНК (до 25 т п н.), у самого вируса геном 187 т. п. н..

3. Безопасен для использования.

Их используют для создания рекомбинантых вирусов, в геном которых встроены гены кодирующие белки-антигены различных болезнетворных вирусов (микробов), создавая при этом иммунитет к инфекционным заболеваниям.

Ретровирусы.

Обладают однонитевой РНК. Их жизненный цикл обязательно проходит через образование двуцепочечной ДНК. Преимущества:

1. Исключительно широкий круг хозяев.

2. Структура интегрированной ДНК исключает возможность перестройки клонированного в ней гена.

3. Клетки не погибают, а продуцируют вирусы в течение многих генераций.

Так же используют:

- аденовирусы;

- бакуловирусы (инфицируют насекомых).

Дата добавления: 2014-12-24