Основные свойства ферментов

К + 1

Т

I

Зависимость между константой равновесия и изменением свободной энергии реагирую-"щих веществ математически принято выражать формулой: AG = —RT\nK, где R — газовая постоянная; Т — абсолютная температура в Кельвинах; In К — натуральный логарифм константы равновесия; ДО - стандартное изменение свободной энергии (Дж/моль). Из представленного уравнения вытекает, что при высоком значении К величина ДО оказывается отрицательной. Подобные реакции сопровождаются уменьшением свободной энергии. При низком значении К величина AG оказывается положительной. Если константа равновесия равна единице, то изменение свободной энергии будет равно нулю и реакция легко обратима.

Для измерения константы равновесия и величины свободной энергии какой-либо хими­ческой реакции, например реакции взаимопревращения глюкозо-1-фосфага в глюкозо-6-фосфат, катализируемой ферментом фосфоглюкомутазой, определяют количество глюкозо-6-фосфата и количество глюкозо-1 -фосфата при достижении химического равновесия. В состоянии равно­весия количество глюкозо-6-фосфата оказывается в 19 раз больше количества глюкозо-1-фосфата. Отсюда константа равновесия К равна 19. Подставляя эту цифру в уравнение, получаем: ДО = —7329 Дж/моль Это означает, что при превращении 1 моля глюкозо-1-фосфата в 1 моль глюкозо-6-фосфата при 25 °С происходит уменьшение свободной энергии системы на 7329 Дж.

,' Таким образом, в механизме ферментативного катализа ведущую роль играют

i промежуточные фермент-субстратные комплексы, образование которых определяется тонкой структурой активного центра и уникальной структурой всей молекулы фер­мента, обеспечивающими высокую каталитическую активность и специфичность дейст­вия биокатализаторов.

^Кинетика ферментативных реакций

Одним из характерных проявлений жизни является удивительная способность живых организмов кинетически регулировать химические реакции, подавляя стремле­ние к достижению термодинамического равновесия. Ферментативная кинетика зани­мается исследованием закономерностей влияния химической природы реагирующих веществ (фермента, субстратов) и условий их взаимодействия (концентрации, рН среды, температуры, присутствия активаторов или ингибиторов) на скорость ферментативной реакции. Главной целью изучения кинетики ферментативных реакций является полу­чение информации, которая может способствовать пониманию механизма действия фермента.

Общие принципы кинетики химических реакций применимы и к ферментативным реакциям. Известно, что любая химическая реакция характеризуется константой термо­динамического равновесия. Она выражает состояние химического равновесия, дости­гаемого системой, и обозначается К_р. Так, для реакции:

Таким образом, константа равновесия равна отношению констант скоростей прямой и обратной реакций. Величину, обратную константе равновесия, принято называть субстратной константой, или, в случае ферментативной реакции, кон­стантой диссоциации фермент-субстратного комплекса, и обозна­чать символом K_s. Так, в реакции:

т. е. K_s равна отношению произведения концентрации фермента и субстрата к кон­центрации фермент-субстратного комплекса или отношению констант скоростей об­ратной и прямой реакций. Следует отметить, что константа K_s зависит от химичес­кой природы субстрата и фермента и определяет степень их сродства. Чем ниже значение K_s, тем выше сродство фермента к субстрату.

При изучении кинетики ферментативных реакций следует учитывать одну важ­ную особенность этих реакций (не свойственную обычным химическим реакциям), связанную сявлением насыщения фермента субстратом. При низкой концентра­ции субстрата зависимость скорости реакции от концентрации субстрата (рис. 4.12) является почти линейной и подчиняется кинетике первого порядка. Это означает, что скорость реакции S -> Р прямо пропорциональна концентрации субстрата [S] и в любой момент времени (г) определяется следующим кинетическим уравнением:

константа равновесия равна произведению концентраций образующихся веществ, де­ленному на произведение концентраций исходных веществ. Значение константы равно­весия обычно находят из соотношения констант скоростей прямой (к₊₁) и обратной (fc_,) реакций, т.е. К_р = k+Jk__v В состоянии равновесия скорость прямой реакции и+1 =k+i[A]-[B] равна скорости обратной: v_₁ =fc-i[C]-[D], т.е. v _{+ 1} =v__t coot-

1 Г" ^-ч~1 l~-w-*fc~l ■

где [S] — молярная концентрация субстрата S; - d[S~\/dt — скорость убыли субстрата;' к' — константа скорости реакции, которая в данном случае имеет размерность, обрат-' ную единице времени (мин~' или с"¹).

При высокой концентрации субстрата скорость реакции максимальна и ста­новится постоянной и не зависящей от концентрации субстрата [S]. В этом случае реакция подчиняется кинетике нулевого порядка: v = к" (при полном насыщении фер­мента субстратом) и целиком определяется концентрацией фермента. Различают, кроме того, реакции второго порядка, скорость которых пропорциональна произ­ведению концентраций двух реагирующих веществ. В определенных условиях при нарушении пропорциональности говорят иногда о реакциях смешанного порядка (см. рис. 4.12).

Изучая явление насыщения, Л. Михаэлис и М. Ментен разработали общую теорию ферментативной кинетики. Они исходили из предположения, что ферментативный процесс осуществляется в виде следующей химической реакции:

т. е. фермент Е вступает во взаимодействие с субстратом S с образованием про­межуточного комплекса ES, который далее распадается на свободный фермент и продукт реакции Р. Математическая обработка на основе закона действующих масс дала возможность вывести уравнение, названное в честь авторов уравнением Михаэлиса — Ментен, выражающее количественное соотношение между концентрацией субстрата и скоростью ферментативной реакции:

где v — наблюдаемая скорость реакции при данной концентрации субстрата [S]; K_s — константа диссоциации фермент-субстратного комплекса, моль/л; К_тах — макси­мальная скорость реакции при полном насыщении фермента субстратом.

Из уравнения Михаэлиса — Ментен следует, что при высокой концентрации суб­страта и низком значении K_s скорость реакции является максимальной, т. е. v = V_mm (реакция нулевого порядка, см. рис. 4.12); при низкой концентрации субстрата, напротив, скорость реакции оказывается пропорциональной концентрации субстрата в каждый данный момент (реакция первого порядка).

Следует указать, что уравнение Михаэлиса — Ментен в его классическом виде не учитывает влияния на скорость ферментативного процесса продуктов реакции, например в реакции:

Е + S ^кЦ ES ^кЦ Е + Р,

*-1 ^к-2

и носит несколько ограниченный характер. Поэтому были предприняты попытки усовершенствовать его. Так было предложено уравнение Бриггса — Холдейна:

_{v =} Кг.ЛЧ.

где К_т представляет собой константу Михаэлиса, являющуюся эксперимен­тально определяемой величиной. Она может быть представлена следующим урав­нением

В числителе представлены константы скоростей распада комплекса ES в двух направлениях (в сторону исходных Е и S и в сторону конечных продуктов реакции

Е и Р). Отношение k-y/k_+i представляет собой константу диссоциации фермент-субстратного комплекса K_s, тогда:

кГ — V _l ⁺²

^{m s} I —■

Отсюда вытекает важное следствие, что константа Михаэлиса всегда больше, чем константа диссоциации фермент-субстратного комплекса K_s, на величину к _{+ 2}/к _{+ 1}.

Для определения численного значения К_т обычно находят ту концентрацию субстрата, при которой скорость ферментативной реакции v составляет половину от максимальной У_тях, т. е. если v = ¹/₂ V_max, то, подставляя значение v в уравнение Бриггса - Холдейна, получаем:

K_ma, ^ K_max-[S]. 2 А

разделив обе части уравнения на F_max, получим:

Таким образом, констант а jVIих аэлиса численно равна концентрации субстрата (моль/л), при которой скорость даннои~фёрментативной реакции составляет половину от максимальной¹. Определение величины К_т имеет важное значение при выяснении механизма действия эффекторов на активность ферментов и т. д. Константу Михаэлиса можно вычислить из графика, представленного на рис. 4.13. Отрезок на оси абсцисс, соответствующий скорости, равной половине максимальной, будет представлять собой К_т.

Следует указать, что пользоваться графиком, построенным в прямых координа­тах зависимости начальной скорости реакции (v₀) от начальной концентрации субстрата [S_o], неудобно, поскольку максимальная скорость (F_max) является в данном случае асимптотической величиной и определяется недостаточно точно.

Для более удобного графического представления экспериментальных данных Г. Лайнуивер и Д. Бэрк преобразовали уравнение Бриггса — Холдейна по методу двойных обратных величин, исходя из того принципа, что если существует

равенство между двумя какими-либо величинами, то и обратные величины также будут равны. В частности, если

которое получило название уравнения Лайнуивера — Бэрка. Это уравнение прямой линии: у = ах + Ь. Если теперь в соответствии с этим уравнением построить график в координатах l/v(y) от l/[S](x), то получим прямую линию (рис. 4.14), тангенс угла наклона которой будет равен величине K_m/V_m3X; отрезок, отсекаемый прямой от оси ординат, представляет собой 1/F_max (обратную величину максималь­ной скорости); если продолжить прямую линию за ось ординат, тогда на оси абсцисс отсекается отрезок, соответствующий обратной величине константы Михаэлиса — \/К_т (см. рис. 4.14). Следует подчеркнуть, что значения F_max, как и К_т, опре­деляются более точно по сравнению с графиком, построенным в прямых координатах, при построении графика по методу двойных обратных величин, поэтому метод нашел широкое применение в современной энзимологии. Предложены также анало­гичные графические способы определения К_т и F_max в координатах зависимости v от v/[S] и [S]/v от [S].

К ферментам применимы три основных критерия, характерных и для неоргани­ческих катализаторов. В частности, они остаются неизменными после реакции', т. е. освобождаясь, могут вновь реагировать с новыми молекулами субстрата (хотя нельзя исключить побочных влияний условий среды на активность фермента). Ферменты оказывают свое действие в ничтожно малых концентрациях (например, одна моле­кула фермента реннина, содержащегося в слизистой оболочке желудка теленка, створаживает около 10⁶ молекул казеиногена молока за 10 мин при 37 °С). Наличие либо отсутствие фермента или любого другого катализатора не оказывает влияния на величину константы равновесия и изменение свободной энергии (AG). Катализато­ры лишь повышают скорость, с которой система приближается к термодинами­ческому равновесию, не сдвигая точки равновесия. Химические реакции с высокой константой равновесия и отрицательной величиной AG принято называть э к з е р г о-ническими. Реакции с низкой константой равновесия и соответственно положи­тельной величиной AG (они обычно не протекают спонтанно) называются э н д е р-гоническими. Для начала и завершения этих реакций необходим приток энергии извне. Однако в живых системах экзергонические процессы сопряжены с эндерго-ническими реакциями, обеспечивая последние необходимым количеством энергии.

Ферменты, являясь белками, обладают рядом характерных для этого класса органических соединений свойств, отличающихся от свойств неорганических катали­заторов.

Термолабильность ферментов. Ско­рость химических реакций зависит от температуры, поэтому катализи­руемые ферментами реакции также чувствительны к изменениям темпе­ратуры. Скорость химической реак­ции повышается в 2 раза при повы­шении температуры на 10 °С. Однако вследствие белковой природы фер­мента тепловая денатурация при по­вышении температуры будет снижать эффективную концентрацию фермен­та с соответствующим снижением скорости реакции. Так, при темпера­туре, не превышающей 45 — 50 °С, скорость реакции увеличивается со­гласно теории химической кинетики. При температуре выше 50 °С на

о,

скорость реакции большое влияние начинает оказывать тепловая дена­турация белка-фермента, приводящая к полному прекращению фермента­тивного процесса (рис. 4.15).

Таким образом, термолабиль­ность, или чувствительность к повы­шению температуры, является одним из характерных свойств ферментов, резко отличающих их от неоргани­ческих катализаторов. В присутствии последних скорость реакции возрас­тает экспоненциально при повышении температуры (см. кривую а на рис. 4.15). При 100 °С почти все ферменты утрачивают свою актив­ность (исключение составляет, оче­видно, только один фермент мышеч­ной ткани — миокиназа, которая вы­держивает нагревание до 100 °С). Оптимальной для действия большин­ства ферментов теплокровных животных является температура 40 °С. При низких температурах (0 °С и ниже) ферменты, как правило, не разрушаются, хотя актив­ность их падает почти до нуля. Во всех случаях имеет значение время воздействия соответствующей температуры. В настоящее время для пепсина, трипсина и ряда других ферментов доказано существование прямой зависимости между скоростью инактивации фермента и степенью денатурации белка. Следует отметить, что на термолабильность ферментов определенное влияние оказывают концентрация суб­страта, рН среды и другие факторы.

Зависимость активности ферментов от рН среды. Ферменты обычно наиболее актив­ны в пределах узкой зоны концентрации водородных ионов, соответствующей для животных тканей в основном выработанным в процессе эволюции физиологическим значениям рН среды 6,0 — 8,0. При графическом изображении на кривой колоколооб-разной формы имеется определенная точка, при которой фермент проявляет макси­мальную активность; эту точку называют оптимумом рН среды для действия данного фермента (рис. 4.16). При определении зависимости активности фермента от кон-

Таблица 4.3. Оптимальные значения рН для некоторых ферментов

Фермент	рн	Фермент	рН
Пепсин Катепсин В Амилаза из солода Сахараза кишечная Амилаза слюны	1,5-2,5 4,5-5,0 4,9-5,2 5,8-6,2 6,8-7,0	Каталаза Уреаза Липаза панкреатическая Трипсин Аргиназа	6,8-7,0 7,0-7,2 7,0-8,5 7,5-8,5 9,5-10,0

центрации водородных ионов реакцию проводят при разных значениях рН среды, обычно при оптимальной температуре и наличии достаточно высоких (насыщающих) концентраций субстрата. В табл. 4.3 приводятся оптимальные значения рН среды для ряда ферментов.

Из табл. 4.3 видно, что рН-оптимум действия ферментов лежит в пределах физиологических значений. Исключение составляет пепсин, рН-оптимум которого равен 2,0 (при рН 6,0 он не активен и не стабилен). Объясняется это тем, что пепсин входит в состав желудочного сока, содержащего свободную соляную кислоту, которая создает оптимальную кислую среду для действия этого фермента. С другой сто­роны, рН-оптимум аргиназы лежит в сильно щелочной зоне (около 10,0); такой среды нет в клетках печени, следовательно, in vivo аргиназа функционирует, по-видимому, не в своей оптимальной зоне рН среды.

Согласно современным представлениям, влияние изменений рН среды на мо­лекулу фермента заключается в воздействии на состояние и степень ионизации кислот­ных и основных групп (в частности, СООН-группы дикарбоновых аминокислот, SH-группы цистеина, имидазольного азота гистидина, NH₂-rpynnbi лизина и др.). При разных значениях рН среды активный центр может находиться в частично ионизи­рованной или неионизированной форме, что сказывается на третичной структуре белка и соответственно формировании активного фермент-субстратного комплекса. Имеет значение, кроме того, состояние ионизации субстратов и кофакторов.

Специфичность ферментов. Ферменты обладают высокой специфичностью дейст­вия. Это свойство часто существенно отличает их от неорганических катали­заторов. Так, мелко измельченные платина и палладий могут катализировать восста­новление (с участием молекулярного водорода) десятков тысяч химических соединений различной структуры. Высокая специфичность ферментов обусловлена, как было упомя­нуто выше, конформационной и электростатической комплементарностью между моле­кулами субстрата и фермента и уникальной структурой активного центра фермента, обеспечивающими «узнавание», высокое сродство и избирательность протекания одной какой-либо реакции из тысячи других химических реакций, осуществляющихся одно­временно в живых клетках.

В зависимости от механизма действия различают ферменты с относительной (или групповой) специфичностью и абсолютной специфичностью. Так, для действия некоторых гидролитических ферментов наибольшее значение имеет тип химической связи в молекуле субстрата. Например, пепсин расщепляет белки животного и растительного происхождения, хотя они могут существенно отличаться друг от друга как по химическому строению и аминокислотному составу, так и по физико-химическим свойствам. Однако пепсин не расщепляет углеводы или жиры. Объясняется это тем, что местом действия пепсина является пептидная —СО—NH-связь. Для действия липазы, катализирующей гидролиз жиров на глицерин и жирные кислоты, таким местом является сложноэфирная связь. Аналогичной групповой специфичностью обладают трипсин, химотрипсин, пептидазы, ферменты, гидроли-зующие ос-гликозидные связи (но не р-гликозидные связи, имеющиеся в целлюлозе) в полисахаридах и т. д. Обычно эти ферменты участвуют в процессе пищеварения,

и их групповая специфичность, вероятнее всего, имеет определенный биологический смысл. Аналогичной относительной специфичностью обладают также некоторые внутриклеточные ферменты, например гексокиназа, катализирующая в присутствии АТФ фосфорилирование почти всех гексоз, хотя одновременно в клетках имеются и специфические для каждой гексозы ферменты, выполняющие такое же фосфорили­рование.

Абсолютной специфичностью действия называют способносгь фермента катализи­ровать превращение только единственного субстрата. Любые изменения (модификации) в структуре субстрата делают его недоступным для действия фермента. Примерами таких ферментов могут служить аргиназа, расщепляющая в естественных условиях (в организме) аргинин, уреаза, катализирующая распад мочевины, и др.

Имеются экспериментальные доказательства существования так называемой сте42_е_о_х_иМ-И-Н-еской специфичности, обусловленной существованием опти­чески изомерных L- и D-форм или геометрических (уме- и транс-) изомеров хими­ческих веществ. Так, известны оксидазы L- и D-аминокислот, хотя в природных бел­ках обнаружены только L-аминокислоты. Каждый из видов оксидаз действует только на свой специфический стереоизомер'.

Наглядным примером стереохимической специфичности является бактериальная аспартатдекарбоксилаза, катализирующая отщепление СО₂ только от L-аспарагино-вой кислоты с превращением ее в L-аланин. Стереоспецифичность проявляют фер­менты, катализирующие и синтетические реакции. Так, из аммиака и а-кетоглутарата во всех живых организмах синтезируется L-изомер глутаминовой кислоты, входящей в состав природных белков. Если какое-либо соединение существует в форме цис- и транс-изомеров с различным расположением групп атомов вокруг двойной связи, то, как правило, только один из этих геометрических изомеров может служить в качестве субстрата для действия фермента. Например, фумараза катализирует превращение только фумаровой кислоты (транс-изомер), но не действует на малеино-вую кислоту (цис-изомер):

Таким образом, благодаря специфичности действия ферменты обеспечивают про­текание с высокой скоростью лишь определенных реакций из огромного разнообра­зия возможных превращений в микропространстве клеток и целостном организме, регулируя тем самым интенсивность обмена веществ.

Дата добавления: 2014-12-27