Краткая история развития учения о ферментах

Резюме по теме

Вопросы для повторения

1. Раскройте организационные формы деятельности адвокатов в США.

2. Какова структура адвокатуры в США?

3. Каковы правовые основы деятельности адвоката в США?

4. Перечислите условия поступления в адвокатуру во Франции.

5. Предоставляется ли бесплатная юридическая помощь во Франции?

В настоящее время Российская Федерация формируется как демократическое правовое государство. Использование зарубежного опыта, в том числе и опыта построения адвокатуры, является необходимым условием построения в России такой правовой системы, которая бы фактически и юридически обеспечила ее экономическое развитие и защищала права и свободы граждан.

Явление брожения и переваривания известно с незапамятных времен, однако зарождение учения о ферментах (энзимологии) относится к первой половине XIX ве­ка. Первое научное представление о ферментах было дано в 1814 г. петербургским ученым К. С. Кирхгофом, который показал, что не только проросшие зерна ячменя, но и экстракты из солода способны осахаривать крахмал с превращением его в мальтозу. Вещество, извлекаемое из проросшего ячменя и обладающее способностью превращать крахмал в мальтозу, получило название амилазы. Ю. Либих и Ф. Велер открыли агент, расщепляющий амигдалин, содержащийся в эфирном масле горького миндаля. Действующий агент, содержащийся в миндале, был назван эмульсином. В

Бактериальное

Врожденные брожение Физиологическая нарушения обмена регуляция

Биохимичесная эволюция

Превращение энергии

Нинетика реакций

Биосинтез

Фармакология

Ноферменты

Натализ

Нлеточный метаболизм

Макромо­лекулы

Питание

Ультраструк­тура мембран

Генетический аппарат

Рис. 4.1. Значение ферментов и энзимологии в био­логии и медицине (по Грину).

после,чующие годы были описаны другие ферменты, в частности пепсин и трипсин, иы н.тающие гидролиз белков в желудочно-кишечном тракте.

Наибольшее внимание исследователей привлекали процессы окисления в организ­ме. Уже был известен феномен химического катализа, означающий, что многие реакции in vitro протекают быстро и энергично в присутствии ничтожных коли­честв примесей, как будто не участвующих в реакции. Так, была установлена боль­шая каталитическая роль ряда неорганических веществ. Горение ыиокозы на воздухе, например, происходит очень медленно, если же добавить немного солей лития (или ю.ты, также содержащей ничтожные количества лития), то горение идет весьма интенсивно:

С₆Н₁₂О₆ + 6О₂ -> 6СО₂ + 6Н₂О

Известно, что в живых организмах «горение» (а точнее окисление) углеводов также протекает быстро и до тех же конечных продуктов обмена, т. е. СО₂ и Н₂О, с выделением (и накоплением) энергии. Однако это «горение» происходит при отно­сительно низкой температуре, без пламени, и что особенно интересно, в присутствии поды. Разумеется, в этих необычных условиях без действия ферментов, получивших наименование биологических катализаторов, не было бы окисления угле-no юн. Забегая несколько вперед, укажем, что в процессе превращения (окисления) 1люкочы в организме до СО₂ и Н₂О участвует последовательно около 15 различных ферментов (см. главу 9).

Биологические катализаторы, т. е. ферменты, как оказалось, не вызывают в от­личие от неорганических катализаторов каких-либо побочных реакций и не осу­ществляют реакций, невозможных по термодинамическим условиям; и те, и другие катализаторы только ускоряют химические реакции, обычно протекающие очень мед­ленно. В качестве примера можно привести реакцию расщепления перекиси водорода на кислород и воду, медленно протекающую и в отсутствие катализатора. В при­сутствии мелкораздробленной платины эта реакция протекает с более высокой ско­ростью:

Эту же реакцию можно провести намного быстрее в присутствии фермента каталазы, содержащейся, в частности, в эритроцитах, причем образуются те же ко­нечные продукты распада перекиси водорода.

Таким образом, можно считать установленным, что ферменты катализируют ряд химических реакций, аналогичных химическим реакциям, катализируемым не­органическими веществами. Более того, считается установленным, что любую из протекающих в живых организмах (или клетках) химическую реакцию можно в принципе осуществить вне организма (или клетки), если экспериментатору удается выделить соответствующий фермент (или систему ферментов), катализирующий дан­ную реакцию, и создать оптимальные условия для его действия.

Горизонты энзимологии. В литературе появились работы, прогнозирующие даль­нейшее развитие энзимологии на ближайшие 10—15 лет. Перечислим основные направления исследований энзимологии будущего. Во-первых, это исследования более тонких деталей молекулярного механизма действия и принципов работы ферментов в соответствии с законами классической органической химии и квантовой механики, а также разработка на этой основе теории ферментативного катализа. Во-вторых, это изучение ферментов на более высоких уровнях (надмолекулярном и клеточ­ном) структурной организации живых систем, причем не столько отдельных фермен­тов, сколько ферментных комплексов в сложных системах. В-третьих, исследование механизмов регуляции активности и синтеза ферментов и вклада химической моди­фикации в действие ферментов. В-четвертых, будут развиваться исследования в об­ласти создания искусственных низкомолекулярных ферментов (синзимов — синтети­ческих аналогов ферментов), наделенных аналогично нативным ферментам высокой специфичностью действия и каталитической активностью, но лишенных побочных антигенных свойств. В-пятых, исследования в области инженерной энзимологии (белко­вой инженерии), создание «гибридных» катализаторов, сочетающих свойства ферментов, антител и рецепторов, а также создание биотехнологических реакторов с участием индивидуальных ферментов или полиферментных комплексов, обеспечивающих полу­чение и производство наиболее ценных материалов и средств для народного хозяйст­ва и медицины.

ХИМИЧЕСКАЯ ПРИРОДА ФЕРМЕНТОВ

В настоящее время получены неопровержимые экспериментальные доказатель­ства белковой природы ферментов'. Трудно сейчас представить, что не только Р. Вильштеттер еще в 1926 г. отрицал принадлежность ферментов к белкам или к какому-либо известному классу органических веществ, но и совсем недавно высказывались сомнения на этот счет. Поводом для сомнения являлись опыты, в которых, хотя и были получены ферментативно активные растворы, но белок не мог быть обнаружен при помощи качественных цветных реакций. Объясняется это.тем, что концентрация фермента при высокой удельной активности оказывалась ниже пороговой чувствительности химического теста на белок.

О белковой природе ферментов говорит факт инактивирования (потери актив­ности) ферментов брожения при кипячении, установленный еще Л. Пастером. При кипячении наступает необратимая денатурация белка-фермента. Фермент при этом теряет присущее ему свойство катализировать химическую реакцию. Точно так же белки при кипячении денатурируются и теряют свои биологические свойства (анти­генные, гормональные, каталитические). Под влиянием различных физических и хими­ческих факторов (воздействие УФ- и рентгеновского излучения, ультразвука, осажде-

ние минеральными кислотами, щелочами, алкалоидными реактивами, солями тяжелых металлов и др.) происходит денатурация ферментов, так же как и белков.

Ферменты при гидролизе, как и белки, распадаются на аминокислоты, что, бес­спорно, служит веским доказательством белковой природы ферментов¹.

Интересные данные, указывающие на белковую природу ферментов, были получены в лаборатории И. П. Павлова. При определении переваривающей способности желудочного сока была обнаружена прямая зависимость между этой способностью и количеством белка в соке. Отсюда было сделано заключение, что пепсин желу­дочного сока является белком.

Вескими доказательствами белковой природы фермента являются его получение в чистом виде и выделение в форме кристаллов белка. К настоящему времени получено более 200 кристаллических ферментов и структура многих из них изучена детально при помощи современных методов химии белков и молекулярной физики [мето­дами рентгеноструктурного анализа, ядерного магнитного резонанса (ЯМР), электрон­ного парамагнитного резонанса (ЭПР) и др.].

Ферменты, как и все белки, обладают р ядом е ррй^тд характерных для высоко-

молекулярных соединений: (амфрхевносхью (могут существовать в растворе в виде анионов, катионов и амфионов), эдекхрофаретиче^кеш подвижностью благодаря нали­чию в них положительных и отрицательных зарядов, а в изоэлектрической точке не обнаруживают подвижности в электрическом поле. Ферменты не_ способны к диалщу^через полупроницаемые мембраны. При помощи диализа их растворы обычно можно освободить от низкомолекулярных примесей. Как белки они легка осаждаются из водных растворов при низких температурах методами высаливания или осторож­ным добавлением ацетона, этанола и других веществ, не теряя при этом своих ката­литических свойств.

Подобно белкам, ферменты имеют бодьцгую _молекуля рцую._ массу - от десятков тысяч до нескольких миллионов дальтон (табл. 4.1).

Таблица 4.1. Молекулярная масса ферментов

Фермент	Молекулярная масса, Да	Фермент	Молекулярная масса, Да
Рибонуклеаза	13 700	Лактатдегидрогеназа
Цитохром с	15 000	Альдолаза	142 000
Трипсин	23 800	Каталаза	248 000
Пепсин	32 000	Глутаматдегидрогеназа	336 000
Гексокиназа	45 000	Уреаза
Щелочная фосфатаза		Пируватдегидрогеназа	4500 000
		(комплекс)

Ферменты обладают высокой специфичностью ц$рг.тп цу что также доказывает их белковую природу, поскольку белки в иммунологическом отношении отличаются крайне высокой специфичностью. Наконец, прямым доказательством белковой природы ферментов является лабораторный синтез первого фермента - рибонуклеазы, осу­ществленный в 1969 г. в лаборатории Б. Меррифилда в Нью-Йорке². Этот авто­матический синтез на твердой фазе состоял в последовательном включении всех 124 аминокислотных остатков в строгом соответствии с последовательностью амино­кислот (с первичной структурой) естественного фермента — рибонуклеазы поджелу-

дочной железы¹. Искусственно синтезированный фермент не отличался от природной рибонуклеазы по химическим, каталитическим и иммунологическим тестам.

Принимая во внимание перечисленные выше обстоятельства, при получении ферментов в чистом виде и при их хранении следует учитывать одно важное свойство белков, а именно ста бильность, которая определяется рядом факторов. Одним из общих правил при работе с ферментами является оптимальная темп ература, обычно соот­ветствующая температуре тела, а для препаративных целей — использование темпе­ратуры около 0°С. Следует, однако, иметь в виду, что имеется несколько фер­ментов, весьма чувствительных к пониженной температуре, в частности митохонд-риальный фермент, катализирующий распад АТФ, при 0°С подвергается инакти­вации, в то время как при комнатной температуре он остается стабильным. Боль­шинство ферментов сохраняют стабильность при рН около 6.0 — 8,0, хотя имеются исключения. Для препаративных целей часто прибегают к обезвоживанию фермента (удалению воды) в вакууме из замороженного раствора (этот метод получил название лиофилизации). Осаждение из раствора ферментов спиртом или ацетоном также проводят при низкой температуре, поскольку при комнатной температуре эти про­цедуры приводят к почти полной потере энзиматической активности. Для стабилизации фермента часто пользуются хелатообразующими агентами, например к ферменту добавляют этилендиаминтетраацетат (ЭДТА):

ЭДТА может связывать нежелательные примеси (содержащиеся в реактивах следы ионов тяжелых металлов: меди, свинца, ртути и др.), оказывающие тормозящий эффект на активность. Одним из непременных условий сохранения стабильности ферментов является хранение их в высушенном или замороженном состоянии (в условиях холода). Многие ферменты стабильны в виде суспензии в концентриро­ванных растворах сульфата аммония.

СТРОЕНИЕ ФЕРМЕНТОВ

В природе существуют как простые, так и сложные ферменты.!^уТервые целиком представлены полипептидными цепями и при гидролизе распадаются исклю­чительно на аминоки слоты. Примерами такого рода ферментов (простых белков) являются гидролитические ферментььв частности пепсин, трипсин, папаин, уреаза, лизо-цим, рибонуклеаза.^осфатаза и щцфопьшинство природных ферментов относятся к классу сложных белков, содержащих; помимо полипептидных, лелей, какой-либо не-бел.К5вщ__кйлшонент„^кофакторХ_присутствие которого является существенным для энзиматической активности. Кофакторы могут иметь различную химическую природу и отличаться по прочности связи с полипептидной цепьюУЕсли константа диссоциа­ции сложного фермента настолько мала, что в растворе все полипептидные цепи оказываются связанными со своими кофакторами и не раздеДЯШ1£я при выделении и очистке, то такой фермент получает название x_oj i о ферм е н т а (холоэнзима), а кофактор — простетической группы, рассматривающейся как интегральная часть

молекулы фермента. Полипептидную часть фермента принято называть а п_о ф е р-Н.е н. т о м.~~1

В литературе до сих пор употребляются и другие наименования компонентов сложных ферментов, в частности фермент-протеид, белковый компонент, кофермент. Под к о ф -С- Р м е н jjjjd часто подразумевают дополнительную группу, легко отделяе­мую от апофермента при диссоциации. Предполагается, что между простетической группой и полипептидной цепью существует ковалентная связь, как, например, в молекуле ацетилкоэнзим-А-карбоксилазы, в которой кофактор биотин ковалентно связан с апоферментом посредством амидной связи (см. главу 5). С другой стороны, химические связи между кофакторами и пептидными цепями могут быть относи­тельно слабыми (например, водородные связи, электростатические взаимодействия и др.). В таких случаях при выделении ферментов наблюдается полная диссо­циация обеих частей, и изолированный белковый компонент оказывается лишенным ферментативной активности, пока не будет добавлен извне недостающий кофактор. Именно к подобным изолированным низкомолекулярным органическим веществам применим термин «кофермент»; типичными представителями коферментов являются витамины В_ь В₂, В₆, РР, содержащие коферменты. Известно также, что и простети-ческие группы, и коферменты активно включаются в химические реакции, выполняя функции промежуточных переносчиков электронов, атомов водорода или различных групп, например амино, ацетильных, карбоксильных.

Следует подчеркнуть, что разницу между простетической группой и коферментом нельзя абсолютизировать, поскольку в одних случаях, например у оксидазы D-амино-кислот, кофактор, представленный ФАД, может быть легко отделен от белковой части путем диализа. Тот же кофактор прочно связан ковалентно с ферментами тканевого дыхания, выполняя функции простетической группы.

Многие двухвалентные металлы (Mg²⁺, Mn^{2 +}, Са²⁺), как будет показано ниже, также выполняют роль кофакторов, хотя их не относят ни к коферментам, ни к простетическим группам. Однако имеется ряд примеров, когда ионы металлов прочно связаны с белковой молекулой, выполняя функции простетической группы. В частности, очищенный фермент, катализирующий окисление аскорбиновой кислоты (витамина С) в дезоксиаскорбиновую кислоту, содержит 8 атомов меди на молекулу; все они настолько прочно связаны с белковой молекулой, что даже не обмени­ваются ионообменными смолами и не отделяются методом диализа. Более того, методами электронного парамагнитного резонанса показано участие ионов меди в промежуточном переносе электронов. Интересно отметить, что ионы меди также наде­лены каталитической активностью при окислении аскорбиновой кислоты, однако эта активность повышается во многие тысячи раз, когда ионы меди соединяются с апоферментом в единый комплекс холофермента.

Данные о важнейших коферментах и простетических группах ферментов, включая их наименование, природу витамина, входящего в их состав, и характер выполняемой биохимической функции, будут рассмотрены детально в главе 5.

Получены доказательства кофакторной функции в ферментативных реакциях ряда биологически активных соединений, не относящихся к витаминам: HS-глутатиона, АТФ, липоевой кислоты, производных нуклеозидов (уридинфосфат, цитидинфосфат, фосфоаденозинфосфосульфат), порфиринсодержащих веществ и др. Сюда же могут быть отнесены тРНК, которые в составе ферментов аминоацил-тРНК-синтетаз при­нимают активное участие в переносе аминокислот в рибосомы, где осуществляется синтез белка (см. главу 13).

Следует отметить одну отличительную особенность двухкомпонентных ферментов, заключающуюся в том, что ни кофактор отдельно (включая большинство кофермен­тов), ни сам по себе апофермент каталитической активностью не обладают, и только их объединение в единое целое, протекающее не хаотично, а в соответствии с программой их структурной организации, обеспечивает быстрое протекание хими­ческой реакции.

Активный центр ферментов

При изучении механизма химической реакции, катализируемой ферментами, иссле­дователя всегда интересует не только определение промежуточных и конечных про­дуктов и выяснение отдельных стадий реакции, но и природа тех функциональных групп в молекуле фермента, которые обеспечивают специфичность действия фермента на данный субстрат (или субстраты) и высокую каталитическую активность. Речь идет, следовательно, о точном знании геометрии и третичной структуры фермента, а также химической природы того участка (или участков) молекулы фермента, кото­рый обеспечивает высокую скорость каталитической реакции.! Так как участвующие в ферментативных реакциях молекулы субстратов часто имеют небольшие размеры по сравнению с молекулами ферментов, было высказано предположение, что при образовании фермент-субстратных комплексов в непосредственный контакт с моле­кулой субстрата, очевидно, вступает ограниченная часть аминокислот пептидной цепи. Отсюда возникло представление об «а к т и в н о м центре» фермента. Под актив ным центром подразумевают уни кальную комбинацию амино _ кисл ртт.ту ос татков в моле­куле фермента, обеспечивающую_непосуг1едстярннпе -взаимодейст вие ее с. молекуло й с убстрата и прям ое участие в акте катал иза (рис. 4.2). Установлено, что у сложных ферментов в состав активного центра входят также простетические группы.

ГВ активном центре условно различают так называемый/к аталитический центр, непосредственно вступающий в химическое взаимодействие с субстратом, и /)с вязывающий цен,т.р, или контактную («якорную») площадку, которая обеспечивает специфическое сродство к субстрату и формирование его комплекса с ферментом. В свою очередь молекула субстрата также содержит функциональ­но различные участки, например субстраты эстераз или протеиназ — одну специфи-

ческую связь (или группу атомов), подвергающуюся атаке со стороны фермента, и один или несколько участков, избирательно связываемых ферментом.

Получены экспериментальные доказательства наличия в активном центре химо­трипсина двух остатков гистидина и остатка серина, схематически представленных в трехмерной структурной модели предшественника этого фермента (рис. 4.3). Выявле­ние химической природы и вероятной топографии групп активного центра является проблемой первостепенной важности; она сводится к определению природы амино­кислот, их последовательности и взаиморасположения в активном центре. Для идентификации аминокислотных остатков используют ряд приемов: применение спе­цифических ингибиторов ферментов (часто это субстратоподобные вещества или аналоги коферментов), методов мягкого (ограниченного) гидролиза в сочетании с химической модификацией, включающей избирательное окисление, связывание, заме­щение остатков аминокислот и др.

*„При помощи методов ингибиторного анализа были сделаны попытки установить общность активных центров у ферментов, относящихся к разным группам. В част­ности, при применении ДФФ (принадлежащего к типу так называемых нервных ядов) имеет место полное выключение активного центра холинэстеразы — фермента, катализирующего гидролиз ацетилхолина на холин и уксусную кислоту. Оказалось, что этот ингибитор имеет близкое структурное сходство с ацетилхолином и подобно ему взаимодействует с ОН-группой остатка серина в активном центре. Вызывая фосфорилирование серина в активном центре ряда других ферментов, ДФФ также инактивирует их действие:

Показано, кроме того, что ДФФ избирательно фосфорилирует в каждом чувстви­тельном к нему ферменте только один остаток серина, наделенный функциональ­ной активностью. Учитывая этот механизм действия ДФФ, сделаны попытки опре­деления природы аминокислот в окружении «каталитического» _д^татка серина у ряда ферментов. Полученные результаты представлены в табл. 4.2. J

Из табл. 4.2 видно, что ферменты, сходные по типу действия, хотя и различаются специфичностью, могут иметь почти одинаковую последовательность аминокислот в тех участках, которые примыкают к остатку серина, несущему функционально активную гидроксильную группу. Существенное значение этой группы серина для акта катализа было доказано, кроме того, химическим ее блокированием или удалением, когда эстеразы полностью лишались ферментативной активности.

Таблица 4.2. Последовательность аминокислотных остатков, расположенных вокруг серина в молекулах ряда эстераз и протеинаi (no Малеру и Кордесу)

Фермент	Последовательность остатков аминокислот вокруг серина
Химотрипсин
Трипсин	Гли—Асп—Сер —Гли—Гли
	Гли-Асп-Сер -Гли-Про-Вал
Тромбин
Эластаза	Асп-Сер -Гли
Бутирилхолинэстераза	Acn-Сер -Гли
Ацетилхолинэстераза	Гли-Глу—Сер -Ала
	Глу-Сер-Ала
Алиэстераза печени
	Гли-Глу-Сер -Ала-Гли-Гли
Щелочная фосфатаза (Е. coli)
	Тре-Асп-Сер -Ала-Сер-Ала
Субтилизин (В. subtilis)
	Гли—Тре-Сер -Мет—Ала
Протеаза (Aspergillus orizae)
	Тре-Сер -Мет-Ала
Фосфоглюкомутаза
	Тре-Ала—Сер -Гис—Асп
Фосфорилаза
	Глн-Иле-Сер -Вал-Арг

Предполагается, что формирование активного центра фермента начинается уже на ранних этапах синтеза белка-фермента (см. главу 13) на рибосоме, когда линейная одномерная структура пептидной цепи превращается в трехмерное тело строго определенной конфигурации.

Образовавшийся белок приобретает функциональную (в частности, каталити­ческую) информацию. Любые воздействия, приводящие к денатурации, т. е. нару­шению третичной структуры, приводят к искажению или разрушению структуры активного центра и соответственно потере ферментом каталитических свойств. Если при подходящих внешних условиях удается восстановить нативную трехмерную структуру белка-фермента (ренатурировать его), то востанавливается и его каталитичес­кая активность. Это было показано впервые на примере рибонуклеазы поджелудоч­ной железы." *

Помимо" активного центра, в молекуле фермента может присутствовать также аллостерический центр (или центры) (от греч. allos — другой, иной и steros — пространственный, структурный), представляющий собой участок молекулы фермента, с которым связываются определенные, обычно низкомолекулярные вещества (назы­ваемые эффекторами или модификаторами), молекулы которых отличаются по строе­нию от субстратов. Присоединение эффектора к аллостерическому центру приводит к изменению третичной и часто также четвертичной структуры молекулы фермента и соответственно конфигурации активного центра, вызывая снижение или повышение энзиматической активности. Ферменты, активность которых контролируется состоя­нием как активного, так и аллостерического центров, получили название аллосте-рических ферментов¹. Отличительной особенностью аллостерических фермен-

тов является наличие в молекуле олигомерного фермента нескольких активных центров и нескольких аллостерических регуляторных центров, пространственно удаленных друг от друга. Схематически аллостерический фермент представлен на рис. 4.4, где каждый из двух симметрично построенных протомеров содержит один активный центр, связывающий субстрат (S), и один аллостерический центр, связывающий эффектор (М₂), т. е. по два центра на молекуле фермента. Получены доказательства, что для суб­страта аллостерические ферменты, помимо активного центра, содержат и так называе­мые эффекторные центры; и хотя при связывании с эффекторным центром суб­страт не подвергается каталитическому превращению, однако он влияет на каталити­ческую эффективность активного центра. Подобные взаимодействия между центрами, связывающими лиганды одного типа, принято обозначать гомотропными в з а и м од ействиями, а взаимодействия между центрами, связывающими лиганды разных типов, — гетеротропными взаимодействиями.

| ИЗОФЕРМЕНТЫ

Изоферменты — это множественные формы фермента, отличающиеся друг от друга по сродству, максимальной скорости катализируемой реакции (активности) или регуля-торным свойствам^

В живой природе имеются ферменты, молекулы которых состоят из двух и бо­лее субъединиц, обладающих одинаковой или разной первичной, вторичной и третич­ной структурой. Субъединицы нередко называют протомерами, а объединенную олиго-мерную молекулу — мультимером (см. главу 1). Схематически строение некоторых ферментов-мультимеров и способы связи протомеров представлены на рис. 4.5.

ц Считается, что процесс олигомеризации придает субъединицам белков повышен­ную стабильность и устойчивость по отношению к действию денатурирующих агентов, включая нагревание, влияние протеиназ. Однако на нынешнем этапе наших знаний нельзя ответить однозначно на вопрос о существенности четвертичной структуры для каталитической активности ферментов, поскольку пока отсутствуют методы, позволяющие в мягких условиях разрушить только лишь четвертичную структуру. Применяемые обычно на практике методы жесткой обработки (экстре­мальные значения рН, высокие концентрации гаунидинхлорида или мочевины) приводят к разрушению не только четвертичной структуры, но и вторичной и третичной структур стабильного олигомерного фермента, протомеры которого оказываются денатури­рованными и как следствие этого лишенными биологической активности.

Следует указать на отсутствие ковалентных, главновалентных связей между субъединицами. Связи между последними в основном являются нековалентными, поэтому такие ферменты довольно легко диссоциируют на протомеры. Удивительной особенностью таких ферментов является зависимость активности всего комплекса от способа упаковки между собой отдельных субъединиц. Если генетически различимые

субъединицы могут сущест­вовать более чем в одной форме, то соответственно и фермент, образованный из двух или нескольких типов субъединиц, сочетающихся в разных количественных про­порциях, может существо­вать в нескольких сходных, но не одинаковых формах. Подобные разновидности фермента и получили название изоферментов (изоэнзимов или, реже, изозимов). В част­ности, если фермент, как в рассмотренном ранее случае ЛДГ, состоит из четырех субъединиц двух разных типов — Н и М, то активный фермент может представлять собой одну из следующих комбинаций: НННН, НННМ, ННММ, НМММ и ММММ или соответственно Н₄, Н₃М, H₂N^ HM₃, М₄, соответствующую изоферментам ЛДГ!, ЛДГ₂, ЛДГ₃, ЛДГ₄ и ЛДГ₅. |

Причем в одних случаях субъедйницы имеют почти идентичную структуру и каждая из них содержит каталитически активный участок (например, Р-галактози-даза, состоящая из 4 субъединиц). В других случаях субъединицы оказываются неидентичными. Примером последних может служить триптофансинтаза, состоящая из двух субъединиц, каждая из которых наделена собственной энзиматической активностью. Однако, только будучи объединенными в макромолекулярную структу­ру, обе субъединицы проявляют триптофансинтазную активность.

Термин множественные формы фермента применим к белкам, ка­тализирующим одну и ту же реакцию, и встречающимся в природе в организмах одного вида. Термин изофермент применим только к тем множественным формам ферментов, которые появляются вследствие генетически обусловленных различий в первичной структуре белка (но не к формам, образовавшимся в результате моди­фикации одной первичной последовательности).

Одним из наиболее изученных ферментов, множественность форм которого де­тально изучена методом гель-электрофореза, является ЛДГ, катализирующая обра­тимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Пять изоферментов ЛДГ образуются из 4 субъединиц примерно одинакового размера, но двух разных типов. Поскольку Н-протомеры несут более выраженный отрицательный заряд при рН 7,0 — 9,0, чем М-протомеры, изофермент, состоящий из 4 субъединиц Н-типа (Н₄), будет мигрировать при электрофорезе с наибольшей скоростью в электрическом поле к положительному электроду (аноду). С наименьшей скоростью будет двигаться к аноду изофермент М₄, в то время как остальные изоферменгы будут занимать промежуточные позиции. Следует подчеркнуть, что изоферменты ЛДГ, обладая почти

одинаковой ферментативной активностью, отличаются по ряду физико-химических свойств: молекулярной массе, электрофоретической подвижности, отношению к акти­ваторам и ингибиторам и др. Однако для каждой ткани в норме характерно свое соотношение форм (изоферментный спектр) ЛДГ. Например, в сердечной мышце преобладает Н₄, т. е. ЛДГ_и а в скелетных мышцах и печени — М₄ (ЛДГ₅), как это видно на рис. 4.6.

Эти обстоятельства широко используют в клинической практике, поскольку изучение картины появления изоферментов ЛДГ (и ряда других ферментов) в сыворотке крови может представить интерес для дифференциальной диагностики органических и функциональных поражений органов и тканей. По изменению содержания изоферментов в сыворотке крови можно судить как о топографии патологического процесса, так и о степени поражения органа или ткани. ^

МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫЕ ФЕРМЕНТНЫЕ СИСТЕМЫ

Особую группу ферментов составляют надмолекулярные (или мультимолекуляр-ные) ферментные комплексы, в состав которых входят не субъединицы (в каталити­ческом отношении однотипные протомеры), а разные ферменты, катализирующие последовательные ступени превращения какого-либо субстрата. Отличительными осо­бенностями подобных мультиферментных комплексов являются не только прочность ассоциации ферментов, но и определенная последовательность прохождения проме­жуточных стадий, продиктованная порядком расположения каталитически активных (различных) белков в пространстве («путь» превращения в пространстве и времени). Типичными примерами подобных мультиферментных комплексов являются пируват-дегидрогеназа и а-кетоглутаратдегидрогенеза, катализирующие окислительное декарбо-ксилирование пировиноградной и а-кетоглутаровой кислот в животных гканях (см. главу 9), и синтетаза высших жирных кислот (см. главу 10). Молекулярные массы этих комплексов в зависимости от источника их происхождения варьируют от 2,3 • 10⁶ до 10-10⁶ Да. Ассоциация отдельных ферментов в единый недиссоциирую-щий комплекс имеет определенный биологический смысл и ряд преимуществ. В част­ности, при этом резко сокращаются расстояния, на которые молекулы промежу­точных веществ должны перемещаться при действии изолированных ферментов. Ряд таких мультиферментных комплексов, иногда называемых ферментными ансамблями, структурно связан с какой-либо органеллой (рибосомы, митохондрии) или с биомембра­ной и составляет высокоор1 анизованные системы, обеспечивающие жизненно важные функции, например тканевое дыхание (перенос электронов от субстратов к кислороду через систему дыхательных ферментов).

\/МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ФЕРМЕНТОВ

Проблема структуры и функции ферментов, а также механизма их действия почти ежегодно подробно обсуждается на многих международных симпозиумах и конгрессах. Важное место отводится рассмотрению структуры активных центров, конкретному механизму действия различных типов ферментов, общей теории энзима-тического катализа. До установления химической природы ферментов гипотезы о механизме действия ферментов опирались на исследования кинетики и модельные опыты химического гомогенного катализа. Повышение скорости химических реакций под действием ферментов объясняли: а) активированием субстрата в результате образования адсорбционных или молекулярных, обратимо диссоциирующих фермент-субстратных комплексов; б) за счет цепных механизмов реакций с участием радикалов или возбужденных молекул. Оказалось, что цепные механизмы реакции не играют существенной роли в биологическом катализе^/ После установления химической при­роды ферментов подтвердилось представление, выдвинутое более 70 лет назад В. Анри, Л. Михаэлисом и М. Ментен, о том, что 1при энзиматическом ката­лизе фермент (Е) соединяется (в принципе обратимо) со своим субстратом (S), образуя нестойкий промежуточный фермент-субстратный комплекс (ES), который в конце реакции распадается с освобождением фермента (Е) и продуктов реакции (Р). Михаэлис не только постулировал образование промежуточного фермент-субстрат­ного (Е8)-комплекса, но и рассчитал влияние концентрации субстрата на скорость реакции. В процессе реакции различают несколько стадий: присоединение молекулы субстрата к ферменту, преобразование первичного промежуточного соединения в один или несколько последовательных (переходных) комплексов и протекающее в одну или несколько стадий отделение конечных продуктов реакции от фермента. Сказанное можно схематически проиллюстрировать следующими примерами:

В реакциях анаболизма, например А + В -> АВ, фермент может соединяться как с одним, так и с другим субстратом или обоими субстратами:

В реакциях катаболизма, например АВ-»А + В:

а) АВ + Е -> ABE Л

б) ABE -^ А + BE I (_а + б + в): АВ + Е ->■ А + В + Е

в) BE ^ В + Е J

На рис. 4.7 представлена схема образования промежуточного фермент-субстрат­ного комплекса. Если фермент в активном центре содержит кофермент, то пред­полагается образование тройного комплекса (рис. 4.8).

Фермент вступает во взаимодействие с субстратом на очень короткий период, поэтому долгое время не удавалось показать образование такого комплекса. Прямые доказательства существования фермент-субстратного комплекса были получены в ла­бораториях Д. Кейлина и Б. Чанса. В настоящее время экспериментальные и математические методы кинетики, термодинамики и статической механики химических реакций позволяют определить для ряда ферментативных реакций кинетические и термодинамические показатели, в частности константы диссоциации промежуточных фермент-субстратных комплексов, константы скорости и равновесия их образования.

В обрлаованид_.ф^2м^т^^^1ржщых комплексов участвуют водородные связи, элекстростатические и гидрофобные_взаимодействия, а также в ряде случаев кова-лентаыё7~^Оординацйонньгеi "связи (примерная схема таких связей представлена на рис.' "4.9): Информация о природе связей между субстратом и связывающим участком активного центра фермента может быть получена методами ЭПР и ЯМР, а также методами УФ- и ИК-спектроскопии. Для каталитической активности фер­мента существенное значение имеет пространственная структура, в которой жесткие участки а-спиралей чередуются с гибкими, эластичными линейными отрезками, обеспе-

Рис. 4.10. Изменения структуры активного центра фермента, вызванные субстратом (схема по Кошленду).

А, В, С - функциональные группы активного центра; 1 - активный комплекс; 2 - неактивный комплекс.

чивающими динамические изменения белковой молекулы фермента. Этим изменениям придается большое значение в некоторых теориях ферментативного катализа. Так, согласно гипотезе «индуцированног о», или «в ы н у ж д е н н о г о», соответст­вия Д. Кошленда каталитически активная конфигурация молекулы фермента и соответственно активного центра может в определенных случаях возникать лишь в момент присоединения субстрата в результате его деформирующего воздействия. Подобная деформация представлена на рис. 4.10. Из рисунка видно, что присоеди­нение субстрата (S) к ферменту (Е), вызывая соответствующие изменения конфор-мации активного центра, в одних случаях приводит к образованию активного комплекса, в других — к образованию неактивного комплекса из-за нарушения про­странственного расположения функциональных групп активного центра в промежуточ­ном комплексе. В настоящее время получены экспериментальные доказательства нового положения о том, что постулированное Д. Кошлендом «индуцированное соответствие» субстрата и фермента создается не обязательно изменениями конформа-ции белковой молекулы, но также геометрической и электронно-топографической перестройкой молекулы субстрата.

'--- В каталитическом процессе существенное значение имеют точное соответствие между ферментом и субстратом, а также термодинамические и каталитические преиму­щества подобного соответствия. Гипотеза «индуцированного соответствия» предпола­гает существование между ферментом и субстратом не только пространственной или геометрической комплементарности, но и электростатического соответствия, обуслов­ленного спариванием противоположно заряженных групп субстрата и активного центра фермента. Точное соответствие обеспечивает образование эффективного комплекса между субстратом и ферментом.

Подобно другим катализаторам, ферменты, с тер модинамической точки зрения, ускоряют химические реакции за счет снижения лЯевшй -активации Q Энергией активации называется энергия, необходимая для перевода всех молекул моля вещества в активированное состояние при данной температуре. Другими словами, это энергия, необходимая для запуска химической реакции, без которой реакция не начинается, несмотря на ее термодинамическую вероятность. Фермент снижает энергию активации путем увеличения числа активированных молекул, которые ста­новятся реакционноспособными на более низком энергетическом уровне (рис. 4.11). Из рисунка видно, что ферментативная реакция имеет более низкую энергию акти-

Ход реанции.

вации. Следует отметить, что как катализируемая ферментом, так и не катализируе­мая им реакция независимо от ее пути имеет одинаковую величину стандартного изменения свободной энергии (AG). ~~]

Дата добавления: 2014-12-27