Методы выделения и очистки белков

ХИМИЯ БЕЛКОВ

ПРЕДМЕТ БИОХИМИИ

Биохимия – наука о химических основах процессов жизнедеятельности, изучающая химические компоненты живых клеток, а также реакции и процессы, в которых они участвуют. Предметом медицинской биохимии являются химические процессы, происходящие в организме человека в норме и при патологии.

Основная цель биохимии - изучение молекулярных основ физиологических функций человека в норме с учетом онтогенеза, молекулярных механизмов развития патологических процессов, предупреждения и лечения болезней, биохимических методов диагностики болезней и контроля состояния здоровья человека.

Ряд выдающихся открытий в биохимии и в некоторых ее разделах – энзимологии, биохимической генетике, молекулярной биологии, биоэнергетике и др., - выдвинули ее в раздел фундаментальных научных дисциплин, сделав орудием решения многих важных проблем биологии и медицины.

Белки - высокомолекулярные азотсодержащие органические вещества, молекулы которых построены из остатков аминокислот, соединенных пептидными связями. Белки называют также протеинами (от греч. рrotos – первый). Свое название они получили, когда в тканях животных и растений были обнаружены вещества, имеющие сходство с белком куриного яйца.

Белки составляют основу и структуры, и функций живых организмов. Природные белки построены из 20 различных аминокислот. Эти аминокислоты могут объединяться в самой разной последовательности, поэтому способны образовывать порядка 10¹⁸ разнообразных белков. Белки обеспечивают существование около 10⁶ видов живых организмов, начиная от вирусов и заканчивая человеком. Каждый организм характеризуется уникальным набором белков.

Содержание белков в различных тканях одного организма неодинаково. Так, в организме человека содержится белков в % от сухой массы: в мышцах – 80, в мозге – 45, в костях – 20.

Элементный состав белков в пересчете на сухое вещество, %: С - 50-54; Н - 6,5-7,3; О - 21-23; N - 15-17; S - до 0,5. В составе некоторых белков в небольших количествах содержатся фосфор, железо, марганец, магний, йод и др. Содержание азота относительно постоянно во всех белках (около 16%), поэтому по белковому азоту можно определять количество белка в биологических объектах.

Белки под действием различных факторов (действие химических реагентов, нагревание и др.) легко подвергаются денатурации: происходит разрушение нативной структуры белков, приводящее к потере некоторых природных свойств, например, растворимости, биологической активности. Поэтому для выделения белков разработаны специальные «щадящие» методы.

Процесс начинают с гомогенизации биологического материала – измельчения до разрушения клеточных структур. Для этого используют пестиковые или ножевых гомогенизаторы, шаровые мельницы, ультразвук, метод попеременного замораживания и оттаивания ткани, метод «азотной бомбы».

Затем проводят экстракцию белков буферными смесями с определенными значениями рН, органическими растворителями. Большинство белков хорошо растворимо в 8-10% растворах солей.

Для фракционирования и очистки белков используют следующие методы.

Высаливание – осаждение белков из раствора при добавлении растворов солей щелочных и щелочноземельных металлов. Метод применяется в клинической практике при анализе белков сыворотки крови, например, для разделения глобулинов (выпадают в осадок при 50% насыщении раствора сульфата аммония) и альбуминов (при 100% насыщении).

Электрофорез основан на различной подвижности белков в электрическом поле в зависимости от значений рН и ионной силы раствора. Применяется в клинической медицине для анализа белковых и пептидных смесей, сыворотки крови.

Ультрацентрифугирование - метод разделения жидких дисперсных сред на компоненты под действием центробежной силы.

Хроматография - физико-химический метод разделения и анализа смесей веществ, основанный на распределении их компонентов между двумя несмешивающимися фазами – неподвижной (сорбент) и подвижной (элюент). В клинических лабораториях хроматографию применяют для разделения и анализа аминокислот, белков, углеводов, фосфолипидов, стероидов в плазме крови, тканевых экстрактах, моче.

Различают следующие виды хроматографии:

- адсорбционная – компоненты смеси разделяются в зависимости от их сорбируемости на твердом адсорбенте;

- распределительная - твердая фаза является опорой для стационарной жидкой фазы (бумажная хроматография);

- ионообменная - используют ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как другие белки беспрепятственно элюируются из колонки;

- гель-хроматография или метод молекулярных сит позволяет разделить белки с разной молекулярной массой: небольшие молекулы проникают в поры геля, тогда как большие молекулы остаются снаружи, двигаясь вместе с подвижной фазой через хроматографическую колонку.

Перспективными видами хроматографии являются высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и газовая хроматография.

Дата добавления: 2015-03-31