Блот-гибридизация

Модификации ПЦР.

Существуют различные модификации ПЦР, которые используют в зависимости от различных целей проведения реакции и характерных анализов амплификата. Для трудно амплифицируемых участков ДНК, когда ДНК присутствует в следовых количествах – ПЦР проводят в 2 этапа, используя в качестве ДНК на 2 этапе амплификацию или доамплификацию (клонирование – размножение до необходимых участков последовательности ДНК).

Для определенных случаев удобно проводить мультиплексную ПЦР, т.е. одновременно амплификацию нескольких участков ДНК. Можно получать меченые продукты ПЦР, можно добавлять в реакционную смесь меченые dNTP. Можно наблюдать в УФ-свете путем обычного окрашивания агарозной смеси этития бромидом.

Одним из эффективных методов идентификации определенных участков ДНК среди электрофоретически разделенных фрагментов является метод блот-гибридизации.

Суть метода: рестрикция геномной ДНК одной или несколькими рестриктазами. Образуются фрагменты ДНК, которые разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном гелях. Затем ДНК подвергается денатурации in situ и переносится с геля на плотный носитель (нитроцеллюлоидный фильтр, нейлоновая мембрана). Сам перенос – блоттинг осуществляется за счет действия капиллярных сил или вакуума. Фиксированную на фильтре ДНК гибридизуют с радиоактивномеченным ДНК или РНК-зондом. Методом авторадиографии определяют положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме.

Блот-гибридизация довольно высокочувствительный метод идентификации последовательности ДНК. При длительной экспозиции (несколько дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК – зонда этот метод позволяет выявлять менее чем 0.1 мг ДНК.

При использовании зонда растворами в несколько сотен оснований уникальная последовательность в 100п.о. может быть выявлена в 10 мг геномной рестрицированной ДНК в виде отдельной полосы на авторадиографе после его экспозиции в течение 12 часов.

Метод позволяет работать с очень короткими олигонуклеотидными последовательностями (min 20 п.о.). Однако требуют хорошего мечения и длительной экспозиции фильтра.

Необходимость работы с чистыми препаратами ДНК, применение радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость этой процедуры делают метод дорогостоящим. Этот метод используется для диагностики генных заболеваний.

Сейчас иногда радиоактивные зонды заменяют зондами нитрата серебра. Гибридизация с меченным ДНК – зондом препаратов ДНК или РНК, нанесенных капельно на твердый матрикс без предварительной рестрикции и электрофореза, носит название дот- или слот – гибридизации (зависит от конфигурации пятна на фильтре):

· округлое – дот – гибридизация

· продолговатое – слот – гибридизация

Методом гибридизации ДНК – зондов с электрофоретически разделенными молекулами РНК носит название нозен-блот. Тогда как вестерн – блот или иммуноблот – это связывание электрофоретически разделенных белков, фиксированных на фильтрах с меченными АТ.

Дата добавления: 2015-04-24