Векторные системы (плазмиды, космиды, фаги). Клонирование

Метод ДНК-зондов. Гибридизация in situ.

Для проведения гибридизации с ДНК – зондами не требуется предварительно выделить и очистить ДНК. Процедуру гибридизации можно проводить не только на геле и фильтрах, не только в растворе, но и на гистологических и хромосомных препаратах – гибридизация in situ.

Вариант метода, при котором в качестве зондов используют ДНК (РНК), меченные флуорохромами, называется FISH – фиш ( флуоресцентная in situ гибридизация ).

Меченый ДНК – зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации хромосом (денатурированные метафазные хромосомы). Предварительная обработка хромосом направлена на облегчение доступа зонда к геномной ДНК.

Важное значение имеет подбор условий – после отмывки не связавшихся молекул ДНК и нанесения светочувствительной эмульсии (например, радиоактивная метка) либо проведение соответствующей обработки – биотин, флуоресцин – меченые ДНК – зонды – места локализации последовательностей ДНК, комплиментарных используемому зонду, можно непосредственно наблюдать в микроскоп в виде характерных жирных полос на соответствующем участке определенных хромосом.

Эта методика особенно эффективна при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДНК, клонированных последовательностей ДНК анонимного происхождения при определении не только хромосомной принадлежности, но и внутрихромосомной локализации генов, когда имеются соответствующие ДНК – зонды. При этом разрешающая способность метода может достигать нескольких хромосомных бэндов.

Разрешающая способность FISH – до 50 тыс.п.о. (1/20 величины среднего хромосомного бэнда). Этот метод используют для тканеспечифичного распределения и внутриклеточной локализации мРНК.

ДНК – зондом может служить любая однонитевая ДНК, ограниченного размера, используемая для поиска комплиментарных последовательностей в молекуле большого размера или среди пула разнообразных молекул ДНК.

В ряде случаев в качестве зондов используют искусственным образом синтезированные олигонуклеотидные последовательности ДНК, размер которых не превышает 30 нуклеотидов. Зондами могут быть и выделенные последовательности ДНК из генома. Однако такие последовательности чаще всего клонируют, чтобы иметь возможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.

Клонирование предполагает встраивание (инсерцию) чужеродной экзогенной ДНК в векторную молекулярную ДНК, обеспечивающую проникновение этой конструкции в бактериальные клетки Коулина.

Химерные молекулы ДНК, составленные из фрагментов разного происхождения, носят название рекомбинантных ДНК.

В качестве клонирующих векторов используют модифицированные плазмиды, фаги, космиды, ретро и аденовирусы и другие генетические конструкции.

Размеры клонируемых ДНК – зондов составляют сотни – тысячи нуклеотидов, что определяется способностью вектора удерживать чужеродный фрагмент ДНК. Особенно широко применяют в качестве векторов плазмидную ДНК.

Плазмиды – небольшие двуцепочечные молекулы ДНК, которые могут присутствовать в различном числе копий в бактериальной клетке.

Открытие плазмид связано с изучением генетической природы антибиотикоустойчивости. Оказалось, что именно плазмиды могут нести гены, сообщающие клетке устойчивость к антибиотикам и потеря чувствительности бактерий к их действию как раз и происходит за счет отбора тех штаммов, в которых имеются плазмиды с сообщающей генетическую информацию.

Плазмиды имеют автономную систему репликации, обеспечивающую поддержание их количества в клетке на определенном уровне (от 1 до нескольких сотен плазмидных генов на клетку).

Обычно для клонирования выбирают плазмиды с ослабленным контролем репликации, что позволяет им накапливаться в клетке в большом количестве. Конструирование плазмидных клонирующих векторов состоит во внесении изменения контроля репликации и добавление или вырезание генов антибиотикоустойчивости или удобных для клонирования иных генетических элементов:

· специфические сайты рестрикции

· инициация и регуляция транскрипции и т.д.

Чаще для клонирования используют плазмиды pBR332 или Col E1 или их поизводные.

Кольцевую молекулу плазмидной ДНК можно легко перевести в линейную форму путем единичного разрыва в месте локализации уникального сайта рестрикции.

Присоединение (встраивание, инсерция) фрагмента чужеродной ДНК к концам линейной молекулы осуществляется с помощью специфических ферментов (лигазы), после чего гибридные плазмиды вновь принимают кольцевую форму. Разработаны достаточно простые и эффективные методы трансформации бактерий, т.е. искусственное введение плазмид в бактериальную клетку, при этом присутствующие в плазмидах гены антибиотикоустойчивости используют в качестве маркеров трансформирующих бактерии для их дальнейшего отбора.

При размножении трансформирующих бактерий происходит ↑ числа копий инсертированного фрагмента ДНК. Т.о. этот чужеродный для бактерии генетический материал может быть получен практически в любых количествах.

Также выделенная из бактерий плазмидная ДНК ли изолированный фрагмент может быть использован в дальнейшем как ДНК – зонд.

Для некоторых целей в качестве клонирующих векторов оказалось удобнее использовать фаги (бактериальные вирусы). Фаговая ДНК существует только в линейной форме, поэтому при её рестрикции образуются только 2 фрагмента, которые сшивают с чужеродной ДНК с образованием химерного фага, технически эта операция проще инсерции.

В последнее время большое распространение получило клонирование в космидах ( конструкция, объединяющая в себе преимущества плазмид и фагов ).

Космиды получены на основе плазмид, но в них введены генетические элементы фага, отвечающие за упаковку ДНК в фаговые частицы, такие векторы могут существовать не только в виде плазмид и бактериальной клетки, но и в виде фаговых частиц in vitro.

Космиды обладают большей клонирующей способностью по сравнению с плазмидными и фаговыми векторами и могут нести до 40 – 45 тыс.п.о. инсертированной ДНК.

Все вышеперечисленные векторы используют для клонирования прокариотических систем.

Векторы, пригодные для направленного переноса в эукариотическую клетку, конструируют на основе прокариотических или дрожжевых плазмид – единственные плазмиды, которые найдены в клетках эукариот, а также используют различные эукариотические вирусы (ретровирусы, аденоассоциированные вирусы).

Дата добавления: 2015-04-24