Прогулки и прыжки по хромосоме. Идентификация и изоляция генов

Библиотека генов. Скрининг библиотек.

56. Секвенирование последовательностей ДНК. Построение рестрикционных карт.

Средний размер гена – 10-30 п.о.

Единица рекомбинации, размеры цитогенетических бэндов и субхромосомных фрагментов ДНК, измеряются миллионами п.о. Переход от этих крупных фрагментов к последовательностям ДНК сопоставим с размерами генов. Осуществляется это с помощью молекулярного клонирования, т.е. получения набора фаговых или космидных клонов, содержащих относительно небольшие последовательности, которые насыщают или полностью перекрывают крупный сегмент ДНК, который предположительно содержит идентифицируемый ген.

Затем проводят упорядочение клонов в соответствии с взаимным расположением инсерцированных в них фрагментов ДНК, осуществляя одновременно молекулярный анализ этих фрагментов с целью идентификации регуляторных или кодирующих областей генов.

Дальнейший поиск в библиотеках генов клонов, содержащих транскрибируемые последовательности ДНК, осуществляют достаточно трудоемкими методами – «прогулки» или «прыжки» по хромосоме.

Прогулка по хромосоме (скользящее зондирование) заключается в последовательном отборе клонов, содержащих частично перекрывающиеся фрагменты ДНК из определенного района генома.

На 1 этапе проводят скрининг в библиотеке генов с помощью маркерной ДНК обязательно сцепленной с геномом. После нахождения положительных клонов, последние сами служат зондами для изоляции других клонов, содержащих перекрывающиеся последовательности ДНК, т.о. каждый раз отобранный фрагмент используют в качестве скриннирующего ДНК – зонда для последующего будущего поиска.

В результате получают набор клонированных фрагментов ДНК полностью перекрывающих область поиска гена. Группа подобных клонов носит название контигов.

С помощью физического картирования инсертированной ДНК в разных клонах удается точно установить степень перекрывания между соседними фрагментами и соответственно упорядочить положение клонов в контигах.

При скриннировании космидных библиотек с выявлением каждого нового клона к участку ДНК полностью перекрытому отобранными зондами в среднем ≈ 20 тыс. п.о. Таким способом редко удается пройти более 200 – 300 тыс.п.о. в одном направлении из-за наличия в геноме повторяющихся и трудноклонируемых последовательностей ДНК.

Для преодоления этих ограничений и ускорения процесса поиска генных последовательностей американским исследователем Ф. Коллинзом, который является президентом программы «Геном человека», был разработан метод «прыжков» по хромосоме. Этот метод позволяет изолировать фрагменты ДНК, отстоящие от генома на 100 тыс. нуклеотидов (длина прыжка), не изолируя при этом все промежуточные последовательности ДНК.

Прыжки начинаются со стартового зонда, т.е. с последовательности гибридизующейся со сцепленными с геном ДНК – маркером. Предварительно геномная ДНК переваривается редко шипящей рестриктазой. В результате чего образуются большие фрагменты ДНК, соответствующие по длине одному «прыжку». Затем эти фрагменты переводятся в кольцевую форму, за счет искусственного присоединения к их концам небольшого маркерного гена, при этом концы рестрикт – фрагментов сближаются.

Кольцевые молекулы ДНК разрезают среднешипящими рестриктазами и из пула относительно небольших фрагментов ДНК отбирают те, которые содержат маркерный ген, а следовательно и окружающие его концевые участки исходных крупных фрагментов.

Отобранные последовательности клонируют в фаговых или космидных векторах, получают библиотеку генов концевых участков. Затем в этой библиотеке проводят скрининг конов, содержащих стартовый зонд, только в этих клонах, комплиментарные зонду последовательности соединены маркерным геном с последовательностями ДНК, отстоящими от стартового участка поиска на длину прыжка. При необходимости промежуточные сегменты ДНК также могут быть клонированы с использованием метода скользящего зондирования.

Остановимся на тех критериях, по которым можно отличить сегменты ДНК, являющимися частями генов, от любых других последовательностей. Условно эти критерии могут быть разделены на 3 группы:

1. исследуют структурные особенности генных последовательностей

2. основана на поиске функциональных участков генов

3. анализируют характер нуклеотидных последовательностей тестируемых фрагментов ДНК

Диагностику структурных участков генов осуществляют с помощью гибридизации с ДНК – зондами или прямым скриннированием библиотек ДНК.

Функциональная диагностика генов включает:

· улавливание экзонов (exon trapping)

· улавливание промотерных участков

· улавливание полисигнальных последовательностей

· перенос генов в иные конструкции и идентификация в них соответствующих транскриптов

Поиск генов может быть осуществлен путем прямого секвенирования крупных фрагментов ДНК с последующим компьютерным анализом нуклеотидной последовательности и сопоставление её с присутствующими в базах данных о найденных генов других видов живых существ.

Дата добавления: 2015-04-24