Метод мембранных ультрафильтров

Определение титра кишечной палочки в воде.

Этот метод был предложен в 1923 году А.С. Разумовым, Е.В. Диановой, А.А. Ворошиловой для учета общей численности бактерий в воде, а метод учета E. coli был разработан К.К. Барсовым на Рублевской водопроводной станции. Мембранные ультрафильтры представляют собой нитрацеллюлозные пленки с различным диаметром пор. Мембранные фильтры выпускают шести номеров.

Таблица 6.

Характеристика мембранных ультрафильтров

№ фильтра	Средняя скорость фильтрования 500 мл воды, мин.	Средний диаметр пор, мкм
	9,0	0,35
	4,5	0,50
	2,5	0,70
	1,16	0,90
	0,60	1,20
	мгновенно	более 1,20

Для определения кишечной палочки наиболее пригодны фильтры № 2 или № 3. При наличии большого количества взвешенных частиц в воде её пропускают через предварительный фильтр № 6.

Подготовка мембранных ультрафильтров к анализу.

Мембранные фильтры, вынутые из фабричной упаковки, проверяют на наличие дефектов (надломы, трещины и др.) и по одному опускают в стакан с дистиллированной водой, подогретой до 50-60º С, постепенно подогревают до кипения и кипятят на спокойном огне 15-20 мин. Бурное кипячение приводит к скручиванию фильтров. Такие фильтры к работе непригодны. Кипячение повторяют 2-3 раза для удаления растворителей, применявшихся при изготовлении фильтров. Подготовленные фильтры после кипячения прикрывают стерильной крышкой, такие фильтры можно использовать на второй и третий день после непродолжительного кипячения.

Фильтрация воды и выращивание колоний.

Фильтрацию воды осуществляют в аппарате Зейтца. Рабочую часть фильтра стерилизуют кипячением или фламбированием. При проведении фильтрации на сетку фильтра Зейтца накладывают кружок простерилизованной фильтровальной бумаги, смоченной стерильной водой, а затем мембранный ультрафильтр, собирают прибор и фильтруют столько воды, чтобы на фильтре выросло не более 50-ти колоний. Водопроводную воду фильтруют в объеме 300-500 мл, загрязненную воду фильтруют после предварительного разведения стерильной водой. После окончания фильтрации мембранный фильтр профламбированным пинцетом переносят на поверхность среды Эндо, так, чтобы между фильтром и питательной средой не было пузырьков воздуха. В одну чашку можно положить несколько фильтров. Чашки помещают крышками вниз в термостат при температуре 37º С на 18-24 часа (при посеве воды из колодцев и открытых водоемов сапрофиты могут подавить рост кишечной палочки, поэтому рекомендуется проращивать фильтры при температуре 41-43º С).

При среде Эндо учитывают пять групп колоний: тёмно-красные с металлическим золотистым блеском, тёмно-красные, розовые и красные, бесцветные с розовым или красным центром, бесцветные прозрачные колонии.

Из 2-х-3-х типично окрашенных колоний с каждого фильтра делают мазки и окрашивают по Граму. Отсутствие в мазках грамотрицательных бесспоровых палочек дает основание для отрицательного ответа; при наличии в мазках грамотрицательных палочек, не образующих спор, с материалом из подозрительных колоний проводят оксидазный тест: для этого мембранный ультрафильтр с выросшими на нем колониями переносят, не переворачивая, на кружок фильтровальной бумаги, смоченный реактивом для определения оксидазной активности бактерий (30-40 мг α-нафтола растворяют в 2,5 мл спирта-ректификата и добавляют 7,5 мл дистиллированной воды и растворяют 40-60 мг диметилпарафенилдиамина). Раствор готовят непосредственно перед употреблением. Через 2-4 минуты определяют результат: все посиневшие колонии, или колонии с синим ободком, не учитывают – эти бактерии обладают положительной оксидазной активностью, и не относятся к группе кишечных палочек. Заключительный этап идентификации – материал из колоний с отрицательной оксидазной активностью (колонии, не изменившие цвет после проведения оксидазного теста) высевают уколом в столбики питательных сред Гисса с лактозой и сахарозой и индикатором. Посевы термостатируют при температуре 37º С 4-5 часов. Кишечная палочка сбраживает лактозу с образованием кислоты и газа. Наличие кислоты определяют по изменению окраски индикатора, газ наблюдают в виде пузырьков в столбике среды, сахарозу кишечная палочка не сбраживает. Если в пробирке с лактозой обнаружена только кислота, то термостатирование продолжают до 24-х часов, если и в этом случае газ не проявляется, результат считают отрицательным.

Пример расчета титра Сoli. При фильтрации 500 мл воды на фильтре выросло 2 колонии, характерных для кишечной палочки. В этом случае титр Сoli составит 250 мл:

500/2=250 мл.

Индекс Сoli = 1000/250=4.

Дата добавления: 2015-07-02