Реакция преципитации

Ход определения.

—Навеску мяса (15 г) измельчают на 40—60 кусочков и переносят в колбу,

— приливают 60 мм дистиллированной воды (мяса можно взять больше или меньше указанного веса, но отношение мяса к воде должно быть 1: 4).

—Содержимое колбы кипятят 30 минут, считая с момента закипания.

—Бульон пропускают через бумажный фильтр и охлаждают.

—В пробирку 3—5 мл фильтрата

— добавляют 5—10 капель люголевского раствора (2 части йода, 4 части йодистого калия и 100 частей воды).

При положительной реакции бульон окрашивается в вишнево-красный цвет, при отрицательной в желтый, при сомнительной в оранжевый.

Мясо собаки, лошади, верблюда, медведя и кошки в большинстве случаев дает положительную реакцию на гликоген (экстракт из мяса кошки может окрашиваться также в оранжевый цвет).

Мясо овцы, козы, крупного рогатого скота, кролика и свиньи на гликоген дает отрицательную реакцию.

Показания этой реакции абсолютного значения для распознавания мяса животных различных видов не имеют. Так, например, мясо молодых животных всех видов дает положительную реакцию на гликоген, мясо же старых и больных животных, а также взятое из области головы и шеи, как правило, дает на гликоген отрицательную реакцию.

Сущность метода. Реакция преципитации основана на выпадении осадка под воздействием преципитирующей сыворотки на соответствующий антиген. Это наиболее точный метод в определении мяса животного того или другого вида. С помощью реакции преципитации можно распознать видовую принадлежность мяса, если оно подверглось посолу или тепловой обработке.

Для постановки реакции необходимо иметь набор соответствующих преципитирующих сывороток. Необходимо также иметь запас нормальных сывороток крови животных различных видов (коровы, лошади, свиньи, овцы, козы, собаки).

При длительном хранении под сыворотки подслаивают хлороформ и разливают их в склянки с притертыми пробками. Предварительно устанавливают титр преципитирующих сывороток и определяют их специфичность.

Титр сыворотки проверяют следующим образом: из нормальной сыворотки крови определенного животного делают последовательные разведения 1: 100, 1: 1000,1: 5000, 1: 10 000 и далее (в зависимости от титра, указанного на этикетке ампулы). Разведения производят в малых пробирках (удобнее с суживающимся нижним концом). К 0,9 мл нормальной сыворотки в указанных разведениях подслаивают пастеровской пипеткой по 0,1 мл преципитирующей сыворотки. Подслаивать можно одной пипеткой, начиная с минимального разведения. Специфичность преципитирующей сыворотки определяют так же, но с сыворотками различных животных.

Преципитирующая сыворотка считается годной, если она имеет титр 1:10 000, т. е. осаждает белок сыворотки животного того вида, на который она изготовлена, в разведении 1:10 000 в течение 10 минут и не дает осадков с сыворотками животных других видов в разведениях 1: 1000 в течение 1 часа.

Для приготовления экстракта пробу исследуемого мяса освобождают от жира и соединительно-тканых волокон, мелко измельчают и помещают в пробирку; туда же приливают физиологический раствор, так чтобы он покрывал мясо слоем в несколько миллиметров. Пробирку не встряхивают. Сырое мясо экстрагируют в течение 3 часов, вареное или засушенное — до суток.

После этого экстракт отсасывают и пропускают через стерильный бумажный фильтр или центрифугируют до полной прозрачности. Концентрация белка в экстракте должна равняться приблизительно 1: 1000. Это определяют следующим образом: стеклянный капилляр длиной около 10 см опускают в экстракт, и последний в силу капиллярности поднимается по трубке (не до конца). Затем тот же капилляр вносят наклонно в концентрированную азотную кислоту, налитую на часовое стекло. Азотная кислота, так же как и экстракт, входит в капилляр. На месте соприкосновения жидкостей в капилляре образуется осадок белка в виде белого кольца. Если осадок получается густой и массивный, то экстракт нужно развести физиологическим раствором и пробу повторить еще раз. Так поступают до тех пор, пока белое кольцо свернувшегося белка не будет едва заметным. Полное отсутствие осадка при постановке капиллярной пробы указывает, что концентрация белка в экстракте менее 1: 1000. С та-ким экстрактом реакцию ставить можно, так как титр преципитирующих сывороток выше чем 1: 1000.

Для постановки реакции преципитации готовят несколько (4—7) рядов мелких пробирок, по три пробирки в ряду. В первые пробирки каждого ряда наливают по 0,9 мл экстракта из исследуемого мяса, во вторые — по 0,9 мл физиологического раствора и в третьи — такой же объем нормальных сывороток различных животных. Сыворотки берут в разведении 1: 1000. Во все три пробирки первого ряда подслаивают различными пастеровскими пипетками по 0,1 мл сыворотки, преципитирующей белок коровы, в пробирки второго ряда — по 0,1 мл сыворотки, преципитирующей белок лошади, в пробирки третьего ряда — по 0,1 мл преципитирующей свиной сыворотки, в пробирки других рядов —по такому же количеству овечьей, козьей и собачьей сывороток.

Реакцию читают на темном фоне. Положительной реакцией считается появление на месте соприкосновения жидкостей в течение первых минут после добавления преципитирующей сыворотки мутно-белого кольца.

Реакция будет специфической, если мутно-белое кольцо появится в течение часа после добавления к экстракту преципитирующей сыворотки; осадки, образовавшиеся спустя час, считаются неспецифическими.

Положительная реакция в первой и третьей пробирках одного ряда показывает, что исследуемое мясо принадлежит животному, которому соответствует специфичность сыворотки. Во всех остальных рядах в первых пробирках реакция должна быть отрицательной, а в третьих пробирках — положительной. Во вторых пробирках всех рядов (контрольная проба с физиологическим раствором) реакция должна быть отрицательной.

Например, если исследуемая вытяжка оказалась приготовленной из мяса лошади, то результат реакции во всех пробирках должен быть следующим (табл.).

Таблица

Содержание пробирок	Преципитирующие сыворотки
КРС	Лошади	Свиньи	Овцы	Козы	Собаки
Исследуемая вытяжка	▬	+	▬	▬	▬	▬
Физиологический раствор	▬	▬	▬	▬	▬	▬
Нормальные сыворотки	+	+	+	+	+	+

Наиме- нование кости	Лошадь	Крупный рогатый скот
Атлант	Края округлые, сильно загнуты вентрально. Еть поперечное отверстие.	Крыловая ямка мелкая. Поперечное отверстие отсутствует.
Эпистрофей	Зубовидный отросток стамескообразной формы. Гребень хорошо Ра-звит, каудально раздваи-вается и срастается с каудсуставным отростком.	Зубовидный отросток имеет вид полого полуцилиндра, а гребень - квадратной пластинки.
Грудные позвонки	Их 18-(19). Остистые отростки кроме первых 4-х на свободных концах сильно утолщены, их каудальные края тупые. Есть каудальная позвоночная вырезка.	Их 13 – (14). Остистые отростки широкие пластинчатые с острыми каудальными краями. Есть боковые позвоночные отростки.
Рёбра	Ширина равномерная, форма пластинчатая или цилиндр, шейка ребра короткая.	Ширина неравномерная, края часто неровные, острые, шейка ребра длинная.
Грудная кость	Клиновидная, сжата с боков, рукоятка сращена с телом и дополняется хрящём, образующим вентральный гребень. Рёберных вырезок 8 пар.	Сжата дорсо-вентрально, каудально сильно расширяется. Вентральный гребень отсутствует. Рёберных вырезок 6 пар.
Поясничные позвонки	Их 6, тела короткие. Края поперечно-рёберных отростков гладкие, длина остистых отростков превышает ширину.	Их 6, тела длинные. Края поперечно-рёберных отростков острые «изрезанные». Остистые отростки широкие и низкие.

Наиме- нование кости	Свинья	Овца	Собака
Атлант	В основании крыльев сзади поперечный канал, идущий в плоскую крыловую ямку.	Поперечного отверстия нет, есть мепозвоночное и крыловое отверстие.	Крылья тонкие, плоские, вытяну-ты латеро-кау-даль-но. Вместо крылового отве-рстия – вырезка.
Эпистрофей	Зубовидный отросток тупой, конусообразный. Гребень крыловидный, узкий и высокий, его задний край дорсально приподнят.	Зубовидный отросток полуцилиндри-ческий, гребень в виде квадратной пластинки. Каудсуставные отростки расположены самостоятельно на дужке позвонка.	Зубовидный отросток цилиндрический, гребень краниально нависает над зубовидным отростком, а каудально сливается с кауд суставными отростками
Грудные позвонки	14-15 (17). Остистые отростки широкие, плас-тинчатые. В основании попере-чных отростков находятся дорсо-вентральные отверстия.	14 (13). Имеются боковые позвоночные отверстия.	13 (12). Остистые отростки толстые. Имеется каудальная поперечная вырезка.
Рёбра	14-15 (17), узкие, спиралевидно изогнуты.	Плоские, тонкие, шейки ребер длинные.	Обручеобразные, узкие, круглые, поверхность тела гладкая.
Грудная кость	Сжата дорсо-вентраль-но, расширяется каудально. Рукоятка массивная, сильно сжата с боков. Рёберных вырезок 5 пар.	Сжата дорсо-вентраль-но, расширяется каудально. Рукоятка с телом образуют тупой угол. Рёберных вырезок 7 пар.	Длинная, призматической формы, состоит из 6 сегментов. Рукоятка выступает бугром впереди первой пары рёбер.
Поясничные позвонки	Их 7. Попе­реч-но-рё­берные от­ростки ду­гооб-разные и имеют в основа­ниии дорсо-вен­траль-ные отвер­стия.	Их 6. Имеется вентральный гребень. Попе­речно-рё­берные от­ростки пос-тавлены горизонтально. Остистые отростки широкие, низкие.	Их 7. Вентральный гребень отсутствует. Попе­речно-рё­берные от­ростки наклонены краниовентрально, их концы утолщены. Остистые отростки длинные.

Наименование	Кролик	Кошка
Эпистрофей	Гребень вытянут вперед.	Гребень вытянут назад.
Грудные позвонки	Остистые отростки высокие.	Остистые отростки низкие.
Грудная кость	6-7-ти раздельная,9-ти раздельная.Рукоятка кости оканчивается тупо.	Рукоятка кости оканчивается остро.
Поясничные позвонки	Сосцевидные отростки имеют по концам выступы, направленные вперед.	Сосцевидные отростки оканчиваются острием
Крестцовая кость	Длинная, с 4-мя высокими остистыми отростками..	Короткая, с 3-мя низкими шишкооб разными – остистыми отростками
Лопатка	Длина в 2 раза больше ширины. Акромион разделен на две части. короткого н	Длина на 1/3 больше ширины. Акромион в виде короткого направления сзади отростка.
Плечевая кость	Хорошо выражена дельтовидная шероховатость.	Дельтовидная шероховатость отсутствует.
Бедренная кость	Имеется большой и малый вертелы только	Имеется только большой вертел.

На тушках кроликов и зайцев на задней лапке должна быть оставлена неснятой шкурка (не менее 3 см).

Задание. Освоить методику определения видовой принадлежности мяса по особенностям строения костей, качественной реакции на гликоген и реакции преципитации.

План работы:

1) описать внешний вид мяса, цвет, количество соединительнотканных образований, соотношение в мясе мышечной и соединительной тканей, внешний вид мяса на поперечном разрезе (зернистость), цвет и консистенцию жировой ткани,

2) установить название костей в полученном комплекте и описать их внешний вид. Определить вид животного по анатомическому строению костей.

3) поставить качественную реакцию на гликоген,

4) поставить реакцию преципитации,

5) дать заключение о видовой принадлежности мяса.

Оборудование и реактивы: —комплекты костей животных различных видов,

— куски мяса животных разных видов (200-400 г) —2,

—пинцет, скальпель и ножницы,

—кастрюля для варки мяса,

— электроплитка,

—весы технохимические (или аптечные) с разновесками,

—фильтры — 5,

—кусочки пергаментной бумаги — 5,

— пробирки химические — 4,

—пробирки (для р-ции преципитации) - 18,

—цилиндры — 2,

— воронки — 4,

—колбы конические — 4,

—пипетки пастеровские — 4—6,

— пипетки мерные на 1 мл — 2,

— пипетки мерные на 10 мл — 2,

— стекла часовые— 2,

—раствор Люголя — 10 мл,

— кислота азотная конц. — 10 мл,

—сыворотки (преципитирующие белок различных животных, и нормальные)

— физиологический раствор — 50 мл,

— дистиллированная вода — 150мл

Литература:

1 Власенко В. В. Пособие. Судебная ветеринарно-санитарная экспертиза мяса диких животных - Куйбышев 1986 С. 109

2 Житенко П. В. и др. Справочник. Ветеринарно-санитарная экспертиза предметов животноводства. – М.: Агропромиздат. 1989 С 150-155

3 Кокуричев П. И. Добин М. А. Основы судебно-ветеринарной экспертизы –Л.: Колос С. 20-42, 202-212

4 Макаров В. А. Практикам по ветсанэкспертизе.- М.: Агропромиздат 1987 С. 13-27

5 Макаров В. А. и др. Ветеринарно-санитарная экспертиза с основами технологии и стандартизации продуктов животноводства - М.: Агропромиздат, 1991 С. 463

6 Образцов В. П. Судебно-ветеринарная экспертиза - Киев 1991г.

7. Сенченко Б.С. «Ветеринарно-санитарная экспертиза сырья животного и растительного происхождения» Ростов-на-Дону, 2001

ПРИЛОЖЕНИЯ

АНАЛИЗ №__________

Дата добавления: 2015-07-13