Окраска по Грамму

Вопрос 3. Микроскопические методы изучения живых микроорганизмов. Метод темнопольной микроскопии. Отличие «темного поля» от «затемненного». Метод фазово-контрастной микроскопии. Практическое применение.

Методы изучения морфологии прокариот

Споры

Для изучения морфологии бактерий из них готовят нативные (прижизненные) препараты и фиксированные мазки, которые окрашивают анилиновым красителем. В основе окраски лежат сложные химические и физико-химические реакции. Протоплазма бактерий, особенно в фиксированных мазках, обладает сродством к основным красителям. Поэтому для их окраски используют главным образом основные красители: метиленовый синий, кристаллический фиолетовый, везувин и др. Для выявления различных структурных элементов в бактериальной клетке применяют нейтральные и кислые краски.

Различают простые и сложные методы окраски (по Граму, Цилю —Нельсену и др.)

микроскопический метод: световая, фазово-контрастная, флуоресцентная, электронная;

культуральный метод (бактериологический, вирусологический);

биологический метод (заражение лабораторных животных);

молекулярно-генетический метод (ПЦР - полимеразная цепная реакция)

серологический метод - выявления антигенов микроорганизмов или антител к ним

Применение в медицинской практике (не нашел): идентификация микроорганизмов, разработка вакцин.

Ответ: Из живой культуры готовят нативные препараты «висячая капля» (препарат на покровное стекло и затем каплей вниз на лунку специального предметного стекла) и «раздавленная капля»»(капля культуры +покровное стекло).

1. Микроскопия в затемненном поле зрения: опускаем конденсор и сужаем диафрагму, что позволяет уменьшить интенсивность освещения препарата. Наблюдение движения бактерий, а также грибы и простейшие.

2. Темнопольная микроскопия. Основана на освещении препарата лучами, идущими в косом направлении и не попадающими в объектив, что делает поле зрения темным. В объектив попадают только те лучи,которые отражаются от имеющихся в препарате микробных клеток, и на общем Темном фоне хорошо видны яркие светящиеся изображения объектов. Освещение препарата косыми лучами создается с помощью темнопольного конденсора с затемненной центральной частью и боковой зеркальной поверхностью. Такой конденсора задерживает центральные лучи,а краевые лучи отражаются от зеркальной поверхности, далее встречая на пути микробные клетки,отражаются от них и попадают в объектив. Видны контуры бактерий но внутренние структуры не различимы. Изучаем подвижность (спирохеты,).

3. Метод фазово-контрастной микроскопии. Универсальный метод микроскопии живых неокрашенных микроорганизмов. Хорошая разрешающая способность. Основной метод изучения микоплазм и L-форм. Метод основан на превращении оптическими средствами фазовых колебаний в амплитудные (неокрашенные микроорганизмы являются «фазовыми»-малоконтрастными). Для фазово-контрастной микроскопии используют обычный микроскоп и дополнительное фазово-контрастное устройство, а также специальные осветители. В результате: на ярко освещенном поле зрения видны контрастные изображения живых, неокрашенных объектов с хорошо различимой внутренней структурой, и подвижность микроорганизмов. Позволяет изучать преператы крови.

Вопрос 4. Методы микроскопии препаратов из живых и фиксированных бактерий. Техника микроскопии с иммерсионной системой. Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия, микроскопия в затемнённом поле (сущность, цель, применение в медицинской практике).

К методам микроскопии препаратов из жывых (см. вопрос 3) и фиксированных бактерий относят:

▪ Светлопольная микроскопия (Предельная разрешающая способность микроскопа 0,2 мкм.)

- сухая (обычная)

- иммерсионная (Иммерсионная (погружная) система применяется для исследования микроорганизмов. Преимущество этой системы по сравнению с сухой заключается в том, что между стеклом и линзой устанавливается однородная (гомогенная) среда (стекло препарата+ + масло) с одинаковым показателем преломления. Поэтому падающие лучи, не подвергаясь преломлению и изменению направления, попадают в объектив, и этим достигается наилучшее освещение мельчайших объектов

▪ Ультрафиолетовая микроскопия (Метод наблюдения в ультрафиолетовых (УФ) лучах позволяет увеличить предельную разрешающую способность микроскопа)

▪ Люминесцентная микроскопия (Основана на использовании явления люминесценции (флюоресценции, холодного свечения) – способности некоторых веществ флюоресцировать, т. е. на доли секунд поглощать падающие на них УФ или коротковолновые (сине-фиолетовые) лучи, а затем снова испускать свет.

▪ Микроскопия в темном поле зрения (см. вопрос 3.)

▪ Фазово-контрастная микроскопия (см. вопрос 3.)

▪ Методы электронной микроскопии (Регистрируя углы рассеяния, интенсивность излучения и энергии вторичных электронов, можно изучать не только рельеф поверхности, но и химический состав образца, а также структуру образца в приповерхностном слое (десятки и сотни нанометров).

Вопрос 5. Простые и сложные методы окраски. Подразделение сложных методов окраски по назначению. Протравы и дифференцирующие вещества. Метод Грама: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Простой метод окраски является одноэтапным (1 краситель –анилиновые, фуксин, генцианвиолет, метиленовый синий в виде растворов или пропитанных бумажек). Окраска 3-5 минут, промывание, высушивание, микроскопия. Можно получить представление о форме, размерах, расположении (но не о деталях строения).

Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:

- Дифференциальные - позволяющие отличить один вид или группу бактерий от других (по Грамму – характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена - кислотоустойчивые).

- предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие

(спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

цель метода	Выявление грамположительных и грамотрицательных бактерий
основной краситель	карболовый раствор генцианвиолета
протрава	раствор Люголя (после окрашивания)
дифференцирующее вещество	этанол
дополнительный краситель	разбавленный карболовый раствор фуксина
способ фиксации препарата-мазка	в пламени спиртовки до окрашивания
этапы окраски	Окрасить раствором генцианвиолета 1 мин. (или с бумажкой – 3 мин.); Нанести на мазок раствор Люголя – 1 мин.; Промыть в этаноле 30 сек.; Промыть водой; Окрасить раствором фуксина 1 мин. (или с бумажкой – 5 мин.); Промыть водой; Высушить
сущность метода	Генцианвиолет образует комплекс с тейхоевыми кислотами в присутствии Люголя, который задерживается многослойным пептидогликаном у грамположительных бактерий. При дополнительной окраске фуксином грамотрицательные бактерии приобретают красный цвет.

1. Вопрос 6. Сложные методы окраски, протравы и дифференцирующие вещества. Метод Циля-Нильсена: сущность, этапы окраски, практическое применение.

Ответ: Сложные методы многоэтапные, различные красители, протравы, дифференцирующие вещества. Сложные методы бывают:

- Дифференциальные (отличить группы (по Грамму - характер клеточной стенки, метод Циля-Нильсена -кислотоустойчивые).

- предназначенные для выявления различных структур (споры- Ожешки, включения волютина-Нейссера, капсула- Бурри-Гинса).

Протравы - химические и физические вещества, повышающие окрашиваемость микроорганизмов. Уплотняют цитоплазму и делают

окраску более прочной, либо разрыхляют клеточную стенку и способствуют проникновению краски в клетку (раствор Люголя в методе Грама, карболовая кислота в методе Циля-Нильсена)

Дифференцирующие вещества - вещества избирательно обесцвечивают одни виды или структуры бактериальных клеток и не обесцвечивают другие (спирт в методе Грама, серная кислота в методе Циля-Нильсена и Ожешко).

Метод Циля-Нильсона:

цель метода	Выявление кислотоустойчивых и некислотоустойчивых бактерий
основной краситель	карболовый раствор фуксина
протрава	карболовая кислота (в момент окрашивания)
дифференцирующее вещество	серная кислота
дополнительный краситель	водный раствор метиленового синего
способ фиксации препарата-мазка	в пламени спиртовки в процессе окраски
этапы окраски	Окрашивать карболовым раствором фуксина (фуксин Циля) через фильтровальную бумажку при осторожном нагревании над пламенем спиртовки 3 раза до появления паров белого цвета (1); Промыть в 5% серной кислоте; Промыть водой; Окрасить раствором метиленового синего 1 мин.; Промыть водой; Высушить
сущность метода	При частичном гидролизе клеточной стенки фуксин взаимодействует с миколовыми кислотами и образует комплекс в присутствии фенола. Фенол разрыхляет бактериальную оболочку и краска проникает внутрь клетки. Кислотоустойчивые -красные, некислотоустойчивые - синие

Практическое применение: для диагностики заболеваний (туберкулез)

Дата добавления: 2015-08-31