Методы культивирования облигатных анаэробов. Способы создания бескислородных условий, применяемая аппаратура. Этапы выделения чистых культур облигатных анаэробов

Питание микроорганизмов. Способы поступления питательных веществ в бактериальную клетку. Классификация по типам питания. Зависимость от источника углерода и энергии. Факторы роста.

По типу питания микроорганизмы делятся на:

• автотрофы – синтезируют все углеродсодержащие вещества из СО2;

• гетеротрофы – в качестве источника углерода используют органические вещества;

• сапрофиты – питаются органическими веществами отмерших организмов;

• паразиты – живу за счет органических веществ живой клетки.

Различают голозойный (поглощение питательных веществ в виде твердых частиц, переваривание в специальных пищеварительных органах, у животных) и голофитный (всасывание через поверхность в виде растворов, у растений, грибов и бактерий) способы питания. Затем питательные вещества должны поступить в клетки.

Механизмы поступления питательных веществ в клетку могут быть следующими.

1. Пассивная (простая) диффузия – за счет разности концентраций веществ в клетке и в среде (очень редко, только вода, кислород и некоторые ионы, чаще другой механизм – облегченная диффузия).

2.Облегченная диффузия – тоже за счет разности концентраций, но с использованием специальных ферментов-переносчиков в мембране (транслоказ), выход продуктов метаболизма осуществляется так же.

3. Активный транспорт (АТ) - против градиента концентраций, с использованием ферментов-переносчиков и затратой энергии,. Различают первичный АТ с использованием химической энергии и вторичный АТ с использованием энергии протонного потенциала (симпорт, антипорт)

В зависимости от источников энергии природы доноров электронов:

фототрофы (фотосинтезирующие), способные использовать солнечную энергию – сапрофиты; хемотрофы (хемосинтезирующие), способные использовать энергию за счет окислительно-восстановительных реакций – патогенные микробы.

В зависимости от доноров электронов хемотрофы подразделяют: хемолитотрофы (хемоавтотрофы) хемоорганотрофы (хемогетеротрофы)

Факторы роста:

Аминокислоты. Многие микроорганизмы нуждаются в тех или иных аминокислотах (одной или нескольких), поскольку они не могут их самостоятельно синтезировать, например, клостридии – в лейцине, тирозине; стрептококки – в лейцине, аргинине и др.

Пуриновые и пиримидиновые основания и их производные. (аденин, гуанин, цитозин, урацил, тимин и др.) являются факторами роста для разных видов стрептококков; некоторые азотистые основания нужны для роста стафилококков и других бактерий.

Липиды (жирные кислоты – компоненты фосфолипидов) нужны для роста некоторых стрептококков и микоплазм.

Витамины, главным образом группы В, входят в состав коферментов. Например: Коринебактерии дифтерии, шигеллы нуждаются в никотиновой кислоте или ее амиде, который входит в состав НАД и НАДФ;

Золотистый стафилококк, пневмококк, бруцеллы –в тиамине (витамин В1), входящего в состав пирофосфата;

Стрептококки некоторые виды, бациллы столбняка –пантотеновой кислоте, являющейся составной частью кофермента КоА и т.д.;

Для многих бактерий факторами роста является фолиевая кислота, биотин, гемы –компоненты цитохромов (гемы необходимы гемофильным бактериям, МКБtbc

2) Особенности метаболизма бактерий: интенсивность обмена веществ, разнообразие типов метаболизма, метаболическая пластичность. Питание бактерий. Классификация бактерий по типам питания. Понятие об аутотрофах, гетеротрофах, сапрофитах, абсолютных и факультативных паразитах, прототрофах, ауксотрофах.

Метаболизм (обмен веществ) - это совокупность биохимических

реакций, протекающих в микробной клетке и направленных на построение ее компонентов и обеспечение ее энергией. Клеточный метаболизм состоит их двух потоков реакций, тесно связанных между собой и лротекающих одновременно: энергетического и конструктивного.

Конструктивный метаболизмом (анаболизмом) - называют поток реакций, направленный на построение вещества клетки (биосинтез) из мелких и простых молекул, в том числе и из поступивших извне с использованием запасенной энергии.

Энергетический метаболизм (катаболизм) - это поток реакций, сопровождаюициися распадом крупных молекул на более мелкие с выделением энергии и запасанием получаемой энергии в форме макроэргических молекул - АТФ, АДФ. ЦТФ (цитидинтрифосфат). УТФ

(уридинтрифосфат) и других, главными из них являются АТФ, которые в дальнейшем расходуются для биосинтеза, для активного движения. осморегуляции и других энергозатратных процессов.

Основными способами получения энергии для большинства микробных клеток являются дыхание (окислительное фосфорилирование) и брожение (субстратное фосфорилирование). При этом в обоих случаях происходит перенос фосфорильной группы от фосфорной кислоты на АДФ с образованием АТФ.

Дыхание по энергетической эффективности во много раз превосходит брожение. В процессе дыхания при полном окислении одной молекулы глюкозы образуется 38 молекул АТФ, А, например, при молочнокислом брожении одна молекула глюкозы даст только 2 молекулы АТФ.

Типы питания. Микроорганизмы нуждаются в углеводе, азоте, сере, фосфоре, калии и других элементах. В зависимости от источников углерода для питания бактерии делятся на аутотрофы, использующие для построения своих клеток диоксид углерода С02 и другие неорганические соединения, и гетеротрофы, питающиеся за счет готовых органических соединений. Аутотрофными бактериями являются нитрифицирующие бактерии, находящиеся в почве; серобактерии, обитающие в воде с сероводородом; железобактерии, живущие в воде с закисным железом, и др.

Гетеротрофы, утилизирующие органические остатки отмерших организмов в окружающей среде, называются сапрофитами. Гетеротрофы, вызывающие заболевания у человека или животных, относят к патогенным и условно-патогенным. Среди патогенных микроорганизмов встречаются облигатные и факультативные паразиты (от греч. parasitos — нахлебник). Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки, например риккетсии, вирусы и некоторые простейшие.

В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода, микроорганизмы делят на две группы. Микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода неорганические соединения, называют литотрофны-ми (от греч. lithos — камень), а микроорганизмы, использующие в качестве доноров водорода органические соединения, — органотрофами.

Учитывая источник энергии, среди бактерий различают фототрофы, т.е. фотосинтезирующие (например, сине-зеленые водоросли, использующие энергию света), и хемотрофы, нуждающиеся в химических источниках энергии.

3) Физиология бактерий: рост и размножение. Пути реализации генетической информации у бактерий (особенности процессов репликации; биосинтез белка, как реализация первичной генетической информации).

Жизнедеятельность бактерий характеризуется ростом — формированием структурно-функциональных компонентов клетки и увеличением самой бактериальной клетки, а также размножением — самовоспроизведением, приводящим к увеличению количества бактериальных клеток в популяции.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты, как и грибы, могут размножаться спорами. Актиномицеты, являясь ветвящимися бактериями, размножаются путем фрагментации нитевидных клеток.

Рост – это согласованное увеличение всех компонентов клетки. Результатом роста является размножение бактерий.

Размножение бактерий – увеличение числа бактерий, популяции. В процессе роста бактериальная клетка увеличивается в 2-3 раза, она интенсивно окрашивается и накапливается РНК. В благоприятных условиях рост заканчивается размножением. У бактерий размножение происходит делением пополам – бинарное деление. Это основной способ размножения у бактерий.

Размножение бактерий. Начинается с репликации - удвоения генома, а затем происходит деление. У бактерий вегетативная репликация т.е. информация передается от родительской клетки к дочерней.

У бактерий репликация саморегулируемая, так в геноме имеются гены, ответственные за репликацию, т.е. саморегулиремый процесс.

Репликация носит полуконсервативный характер. То есть дочерние клетки получают равномерно распределяющийся генетический материал. Репликация начинается с определенной точки – локус ДНК. От этой точки происходит раскручивание нитей ДНК, образуется репликационная вилка, синтезируется SSB белок, который препятствует повторному скручиванию нитей. Процесс осуществляется ДНК полимеразой, которая способна присоединять комплиментарные нуклеотиды к свободному 3”концу. Синтез комплиментарных участков запускается заправкой праймером. Это участок РНК, комплиментарный матричной ДНК и у праймера имеется свободный 3’ конец. Заправка праймером запускает синтез ДНК, на матрице строятся фрагменты ДНК(оказаки), которые сшиваются в единую нить ДНКлигазами. В бактериальной клетке образуются 2 идентичные нити ДНК, которые растаскиваются по полюсам клетки и после репликации запускается деление бактерий. Оно начинается с удлинения цитоплазматической мембраны, она удлиняется, формируется межклеточная перегородка по экватору, по которой бактерия бинарно делится и образуются 2 идентичные дочерние клетки

4) Культивирование бактерий: условия, питательные среды (их классификация по целевому назначению). Принципы работы питательных сред. Культуральные свойства бактерий. Примеры.

В лабораторных условиях микроорганизмы выращивают на питательных средах, которые должны быть стерильными, прозрачными, влажными, содержать определенные питательные вещества (белки, углеводы, витамины, микроэлементы и др.), обладать определенной буферностью, иметь соответствующий рН, окислительно-восстановительный потенциал. Питательные среды классифицируют по консистенции-—жидкие, полужидкие, плотные (твердые); происхождению — животного или растительного происхождения и синтетические среды, приготовленные из определенных химически чистых соединений в точно указанных концентрациях; по назначению — общеупотребительные (универсальные), дифференциальные, элективные и среды обогащения, специальные.

По назначению:

Обычные (простые) среды пригодны для культивирования многих видов патогенных и непатогенных бактерий.

Дифференциальные среды позволяют различать бактерии разных видов и родов по их культуральным и биохимическим свойствам.

Элективные (избирательные) среды и среды обогащения, благоприятствующие размножению бактерий определенных видов и подавляющие рост других микробов.

Специальные среды — наиболее оптимальные для выращивания бактерий, не размножающихся на общеупотребительных средах.

К культуральным или макроморфологическим свойствам относятся характерные особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.

Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из одной клетки (клон клеток)

Примеры: При росте на жидких питательных средах бактерии чаще всего вызывают равномерное помутнение, иногда — выпадение осадка: крошковатого (стрептококки), хлопьевидного (стрептобациллы), бульон при этом остается прозрачным. Некоторые бактерии образуют пленку на поверхности жидкой среды: сухую чешуйчато-бородавчатую (туберкулезная палочка), тонкую, нежную (холерный вибрион), рыхлую, с отходящими вниз отростками — «сталактитами» (возбудитель чумы). Еще более разнообразен рост бактерий на плотных питательных средах

благоприятным, ограничивает их рост также бедность пептонной воды питательными веществами.

5) Чистая культура бактерий. Методы выделения чистых культур аэробов и анаэробов. Принципы, на которых основаны данные технологии. Выделение чистых культур по Дригальскому.

Чистой культурой называется популяция бактерий одного вида или одной разновидности, выращенная на питательной среде. Многие виды бактерий подразделяют по одному признаку на биологические варианты — биовары. Биовары, различающиеся по биохимическим свойствам, называют хемоварами, по антигенным свойствам — сероварами, по чувствительности к фагу — фаговарами. Культуры микроорганизмов одного и того же вида, или биовара, выделенные из различных источников или в разное время из одного и того же источника, называют штаммами, которые обычно обозначаются номерами или какими-либо символами. Чистые культуры бактерий в диагностических бактериологических лабораториях получают из изолированных колоний, пересевая их петлей в пробирки с твердыми или, реже, жидкими питательными средами. Чистую культуру бактерий получают для проведения диагностических исследований — идентификации, которая достигается путем определения морфологических, культуральных, биохимических и других признаков микроорганизма.

Методы выделения чистых культур бактерий.

Универсальным инструментом для производства посевов является бактериальная петля. Кроме нее, для посева уколом применяют специальную бактериальную иглу, а для посевов на чашках Петри — металлические или стеклянные шпатели. Для посевов жидких материалов наряду с петлей используют пастеровские и градуированные пипетки. Первые предварительно изготовляют из стерильных легкоплавких стеклянных трубочек, которые вытягивают на пламени в виде капилляров. Конец капилляра сразу же запаивают для сохранения стерильности. У пастеровских и градуированных пипеток широкий конец закрывают ватой, после чего их помещают в специальные пеналы или обертывают бумагой и стерилизуют.

При пересеве бактериальной культуры берут пробирку в левую руку, а правой, обхватив ватную пробку IV и V пальцами, вынимают ее, пронося над пламенем горелки. Удерживая другими пальцами той же руки петлю, набирают ею посевной материал, после чего закрывают пробирку пробкой. Затем в пробирку со скошенным агаром вносят петлю с посевным материалом, опуская ее до конденсата в нижней части среды, и зигзагообразным движением распределяют материал по скошенной поверхности агара. Вынув петлю, обжигают край пробирки и закрывают ее пробкой. Петлю стерилизуют в пламени горелки и ставят в штатив. Пробирки с посевами надписывают, указывая дату посева и характер посевного материала (номер исследования или название культуры).

Посевы «газоном» производят шпателем на питательный агар в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлей или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара. Затем проводят шпатель через пламя горелки, остужают его о внутреннюю сторону крышки и растирают материал по всей поверхности среды. После инкубации посева появляется равномерный сплошной рост бактерий.

Метод Дригальского.

■ 1-й этап. Рассев исследуемого материала по поверхности плотной питательной среды с целью получения изолированных колоний. Может включать предварительную микроскопию исследуемого материала

Посевы «газоном» производят на плотную питательную среду в чашке Петри. Для этого, приоткрыв левой рукой крышку, петлёй или пипеткой наносят посевной материал на поверхность питательного агара по методу Дригальского.

■ 2-ой этап Макро- и микроскопическое изучение выросших колоний и отсев колонии, характерной для определенного вида на скошенный агар или чашку Петри со свежим агаром для получения чистой культуры.

■ По результатам посева серийных разведений исследуемого материала выбирают чашку Петри, удобную для подсчета колоний

■ Подсчет колоний

Механические методы:

1. Посев уколом в столбик сахарного агара.

2. Метод Виньял-Вейона: в расплавленный и остуженный до 50° С агар вносят исследуемую анаэробную культуру, перемешивают и засасывают в пастеровскую пипетку, конец которой запаивают. Через 24 — 48 часов столбике агара вырастают ясно видимые колонии микробов — анаэробов.

3. Метод Перетца. Исследуемый материал вносят в 3 пробирки с физиологическим раствором, а затем в 3 пробирки с остуженным до 50° С МПА. Содержимое пробирок перемешивают и выливают в 3 стерильные чашки Петри, на дно которых предварительно кладут стерильное предметное стекло, через 18-20 часов инкубации в термостате под пластинками стекла вырастают анаэробы.

Физические методы:

1. Анаэростат — создание вакуумных условий.

2. Аппарат Киппа — замена воздуха индифферентным газом (водородом).

3. Среда Китт-Тароцци — содержит кусочки печени, обладающие высокой адсорбционной способностью, 0.5% глюкозы. Перед посевом среду кипятят на водяной бане не менее 15 минут, сверху заливают слоем вазелиного масла, чтобы предохранить посев от проникновения кислорода,

Дата добавления: 2015-08-31