Указания к оформлению лабораторной работы

Ход работы

Исследуемый материал и реактивы

Лабораторная работа №23

Указания к оформлению лабораторной работы

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (активность фермента, моль/ч*л) и сделайте выводы о возможных причинах отклонения полученных результатов от нормальных величин.

Контрольные вопросы

1. Какие реакции катализируют и к какому классу ферментов относятся АлАТ и АсАТ?

2. Почему АлАТ и АсАТ называют индикаторными ферментами?

3. Назовите нормальные величины активности исследованных Вами ферментов?

Определение мочевины в крови по реакции с диацетилмонооксимом (набором реагентов)

Одним из главных продуктов азотистого обмена в организме является мочевина. Синтезируется она в печени, оттуда поступает в кровь и выделяется с мочой. Мочевина составляет около 50% остаточного азота крови. В норме в сыворотке крови содержание мочевины колеблется от 2,5-8,3 ммоль/л. У детей от 1 года до 14 лет – 1,63-6,64 ммоль/л. С мочой взрослого человека за сутки выводится 20-35г, а в возрасте от 1 года до 14 лет – 4,0-16,0г мочевины.

В клинической лабораторной практике определение мочевины необходимо для оценки белкового обмена; своевременной диагностики и лечения врожденных нарушений орнитинового цикла реакций синтеза мочевины; помощи в оценке работы выделительной функции почек, степени почечной и печеночной недостаточности.

Повышение концентрации мочевины в крови (азотемия) отмечается при заболеваниях почек (нарушение их выделительной функции), при усиленном распаде белков, избыточном белковом питании, в случае обезвоживания организма (относительная азотемия), при отравлении фосфором.

Пониженное содержание мочевины в крови и выделение её с мочой наблюдается при заболеваниях печени (дистрофия печени, цирроз, паренхиматозная желтуха), что связано с нарушением её мочевинообразовательной функции; при нефрите, ацидозе, уремии.

Принцип метода. В кислой среде в присутсвии тисемикарбазида и ионов трехвалентного железа мочевина образует с диацетилмонооксимом комплексное соединение красного цвета, оптическая плотность которого при 510нм пропорциональна концентрации мочевины.

1. Сыворотка (плазма) крови без гемолиза. 2. Вата. 3. Спирт. 4. Скарификатор. 5. Реакционная смесь сухая (4 пробирки). 6. Раствор соли железа трехвалентного (5 ммоль/л). 7. Калибровочный раствор мочевины (8 ммоль/л). 8. Кислота серная, концентрированная (96%), х.ч. 9. Кислота трихлоруксусная, ч

А. Приготовление раствора серной кислоты. В мерную колбу вместимостью 500 мл помещают около 300 мл дистиллированной воды и при постоянном помешивании добавляют 50 мл серной кислоты. После охлаждения доливают водой до метки. Раствор устойчив.

Б. Приготовление раствора реакционной смеси. В мерную колбу вместимостью 100 мл количественно переносят содержимое пробирки сухой реакционной смеси и растворяют его примерно в 60 мл дистиллированной воды при нагревании 40-50⁰С. После охлаждения добавляют 1 мл раствора соли железа трехвалентного и доливают водой до метки. Раствор стабилен при комнатной температуре в течение 2 недель. Наличие небольшого количества нерастворимого осадка не мешает определению.

В. Приготовление рабочего раствора. Приготовляют смешением 1 доли раствора реакционной смеси с 1 долей раствора серной кислоты. Ежедневно готовят свежий рабочий раствор.

Г. Приготовление раствора ТХУ 50 г/л (для депротеинирования). 10г ТХУ растворяют в 200 мл дистиллированной воды. Раствор устойчив.

Д. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (без депротеинирования). Образцы: сыворотка (плазма) крови. В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

	Холостая проба, мл	Калибровочная проба, мл (DК)	Опытная проба, мл (D0)
Сыворотка (плазма) крови	–	–	0,01
Калибровочный раствор мочевины	–	0,01	–
Рабочий раствор	2,00	2,00	2,00

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, отверстия закрывают алюминиевой фольгой и пробирки помещают точно на 10 минут в кипящую водяную баню. Затем пробирки быстро охлаждают в потоке холодной воды и измеряют оптическую плотность при 510нм (490-540нм, зеленый светофильтр) против холостой пробы в кювете с толщиной поглощающего слоя 1,0 или 0,5см. Параллельно обрабатывают калибровочный раствор. Окраска устойчива в течение 15 минут.

Е. Определение концентрации мочевины в сыворотке крови (с депротеинированием). Образцы: сыворотка (плазма) крови липимическая или гемолизированная, цельная кровь.

В пробирки внести реактивы по следующей схеме:

	Холостая проба, мл	Калибровочная проба, мл (DК)	Опытная проба, мл (D0)
Раствор ТХУ	0,1	0,5	0,5
Сыворотка (плазма) крови	–	–	0,05
Калибровочный раствор мочевины	–	0,05	–
Перемешать и центрифугировать 10 минут при 3000 об/мин
Надосадочная жидкость	–	0,1	0,1
Рабочий раствор	2,0	2,0	2,0

Далее проводят определение, как при анализе без депротеинирования.

Содержания мочевины производят по формуле:

,

где: С – содержание мочевины в опытной пробе, ммоль/л; D₀ – оптическая плотность опытной пробы; D_К – оптическая плотность калибровочной пробы; 8,0 – содержание мочевины в калибровочном раствора, ммоль/л.

Примечания: при содержании мочевины в крови свыше 17 ммоль/л пробу следует развести дистиллированной водой и анализ провести повторно. Результат умножить на разведение.

При использовании кюветы другого объема расход реактивов может быть пропорционально изменен при сохранении соотношения проба/рабочий раствор 1:100.

В тетради для лабораторных работ запишите ход работы, полученные результаты (концентрацию мочевины в сыворотке крови, ммоль/л) и сделайте выводы о состоянии белкового обмена, работе печени и почек исследуемого.

Контрольные вопросы

1. Где и как образуются конечные продукты обмена простых белков? Назовите их.

2. В чем биологический смысл синтеза мочевины?

3. Напишите схему синтеза мочевины.

Дата добавления: 2017-02-01