Тема 9. Живлення мікроорганізмів 2 страница

Роздільна здатність мікроскопа залежить від довжини хвилі світла, освітлюваного препарату (наприклад, при освітленні ультрафіолетовими променями роздільна здатність зростає), величини апертури, показника заломлення того середовища, яке знаходиться між об’єктом та лінзою об’єктива. Замінюючи повітряне середовище між лінзою об’єктива і об’єктом мікроскопічного дослідження на імерсійну речовину (імерсійна олія, вода), можна підвищити роздільну здатність, оскільки показник заломлення світла (n) для імерсійної олії, дорівнює 1,515, а для повітря – n=1,0. Окрім того, показники заломлення імерсійної олії та скла (n=1,52) майже однакові, що зумовлює відсутність заломлення променів і потрапляння їх в об’єктив без зміни напрямку. У зв’язку з дуже малими розмірами мікроорганізмів для їх вивчення головним чином використовують імерсійні об’єктиви.

Перед початком роботи необхідно перевірити справність мікроскопа та чистоту оптики.

Настроїти освітлення: 1) підняти до упора конденсор, відкрити діафрагму, установити плоске дзеркало, 2) опустити об’єктив малого збільшення ×8 на відстань близько 0,5 см від предметного скла й повертаючи дзеркало відрегулювати освітлення таким чином, щоб усе поле зору було освітлене рівномірно та яскраво.

Після встановлення світла на сухий фіксований забарвлений препарат (демонстраційний) наносять краплю імерсійної олії. Установлюють об’єктив ×90 та, дивлячись збоку, обережно опускають макрометричним гвинтом тубус мікроскопа до занурення об’єктива в олію. Слідкують за тим, щоб фронтальна лінза об’єктива не торкнулась предметного скла, не пошкодила і не роздавила його. Потім, спостерігаючи в окуляр, макрогвинтом повільно підіймають тубус і фокусують об’єкт. Тонке фокусування здійснюють за допомогою мікрометричного гвинта.

Після роботи кедрову олію швидко знімають із об’єктива та конденсора клаптиком фільтрувального паперу, а потім витирають ватним чи марлевим тампоном, змоченим очищеним бензином.

3. Дослідження морфології мікробів у забарвленому стані є найбільш розповсюдженим у мікробіології методом. Фіксовані забарвлені препарати використовуються також для кількісного обліку мікроорганізмів, перевірки чистоти культури. Ці препарати вигідні тим, що можуть зберігатися довгий час.

Фіксовані зафарбовані препарати розглядають за допомогою імерсійного обיєктива. Етапи їх приготування:

а) приготування мазка. Для приготування мазка з агаризованої культури на середину чистого предметного скла наносять прожареною над вогнем петлею, краплю фізіологічного розчину, а потім петлею з пробірки ‑ трохи матеріалу, занурюють його в краплину, розтирають і рівномірно розподіляють по склу в розмірі приблизно на 1 см. Мазок повинен бути тонким. Викладач демонструє техніку приготування мазків із рідкої культури, патологічного матеріалу, крові;

б) висушування. Препарати висушують при кімнатній температурі на повітрі. Для прискорення цього процесу препарат можна підігріти теплим повітря високо над полум’ям пальника, тримаючи скло мазком догори;

в) фіксація. Фіксація дозволяє вбити мікроби, забезпечити краще прилипання мазка до скла, зробити мазок більш чутливим до фарбування. Для фіксації сухий препарат декілька разів проводять через полум’я пальника. Швидкість і кратність проведення препарату через полум’я регулюється відчуттям опіку на пальцях. Не можна перегрівати препарат, так як порушується структура клітин.

У ряді випадків фіксація прогріванням виявляється дуже грубою (у разі вивчення внутрішньої структури бактеріальної клітини, мазків із крові та інших матеріалів, які мають тваринні клітини). Тоді препарат фіксують різними фіксаторами: етиловим, метиловим спиртами, розчином Никифорова тощо.

г) фарбування. Клітини мікроорганізмів фарбують головним чином аніліновими барвниками. Розрізняють кислі барвники (еозин, кислий фуксин), які інтенсивно зв’язуються з цитоплазматичними (основними) компонентами клітини та основні – метиленовий синій, основний фуксин, генціановий фіолетовий тощо, які більш інтенсивно зв’язуються з ядерними (кислими) компонентами клітини. У ході дослідження мікроорганізмів використовуються майже всі основні барвники, оскільки бактерії щодо барвників поводять себе так, начебто вони складаються в основному з нуклеїнової кислоти, яка реагує з основними барвниками, що забезпечує забарвлення клітин.

Розрізняють прості та диференційні способи фарбування мікроорганізмів. Під час простого фарбування забарвлюється вся клітина, отже, стають добре видимими її форма та розміри.

Фіксовані препарати кладуть на дві паралельні, з’єднані резиновими трубками, скляні палички, які вміщені на бортах кювети, вкривають розчином одного з барвників (метиленовою синькою чи водним розчином фуксину), який залишають на 2 – 5 хвилин. Потім препарат промивають, висушують за допомогою фільтрувального паперу. На сухий препарат (пофарбований) наносять краплю імерсійної олії і вивчають за допомогою імерсійного об’єктива.

Кожен студент готує препарати з агаризованих культур Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, фарбує його й проводить мікроскопічне дослідження в імерсійній системі.

Переглядаючи препарати, слід звернути увагу на форму, розміри та розміщення клітин мікроорганізмів. рисунок препаратів роблять кольоровим олівцем із підписом мікроорганізму латинською мовою.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури: Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Escherichia coli, готові забарвлені препарати, мікробіологічна петля, фільтрувальний папір, мікроскоп МБІ – 1, імерсійна олія, предметне скло, бензин, фарби – кислий фуксин, метиленова синька, дистильована вода.

Тема 2. Загальна характеристика світу мікроорганізмів

Запитання для обговорення

1. Місце мікроорганізмів у системі живих істот.

2. Гриби, особливості їх організації, функціонування та розмноження. Класифікація грибів.

3. Загальна характеристика найпростіших. Характеристика основних груп.

4. Водорості. Поширення та значення в природі.

Самостійна робота

1. Вивчення морфології грибів Aspergillus, Penicillium, Mucor.

2. Приготування забарвлених препаратів із культур Saccharomyces vini, Candida tropicalis.

3. Дослідження готових препаратів найпростіших.

4. Зарисовування досліджених препаратів із культур мікроорганізмів.

Методичні вказівки

Мікроскопічне вивчення культур цвілевих грибів проводять у чашках Петрі за допомогою об’єктива малого збільшення (×8). Покласти відкриту чашку Петрі з культурою гриба на предметний столик. Сфокусувати препарат. Досліджуючи культуру мукорової цвілі (Mucor) звернути увагу на наявність несептованого міцелію, від якого відходять несептовані спорангіоносці з кулеподібними розширеннями зверху (спорангії), наповненими ендоспорами. Культури сумчастих грибів (Ascomycetes) представлені двома видами – Aspergillus та Penicillium. У аспергільових грибів нитки септованого міцелію, переплітаючись одна з одною, утворюють густу грибницю, від якої відходять одноклітинні конідієносці, які закінчуються віялоподібним розширенням (стерігми зі спорами – конідіями). У пеніцилових грибів, на відміну від аспергилів, від грибниці відходять септовані конідієносці, які закінчуться у вигляді китички із стерігм та конидій.

Розглянути готові забарвлені препарати різних дріжджів: круглі, овальні, паличкоподібні. Звернути увагу на їх форму, розміри, брунькування.

2. Вивчити готові препарати найпростіших: амеби, лямблії, малярійного плазмодія, трипаносоми, інфузорії. Усі препарати замалювати.

3. Із агаризованих культур дріжджів приготувати препарати, пофарбувати простим методом і промікроскопувати. Визначити форму, розміри, особливості брунькування. Зробити рисунок.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури: Aspergillus, Penicillium, Mucor, Saccharomyces vini, Candida tropicalis, вирощені на чашках; готові забарвлені препарати дріжджів, найпростіших; мікроскопи МБІ-1, МБР, імерсійна олія, фільтрувальний папір, фарби – кислий фуксин, метиленова синька, дистильована вода.

Тема 3. Різноманітність морфологічних форм бактерій

Запитання для обговорення

1. Бактерії кулястої форми.

2. Циліндрична форма бактерій.

3. Бактерії спіральної форми.

4. Незвичні форми бактерій. Нитчасті форми.

5. Плеоморфізм бактерій.

Самостійна робота

1. Мікроскопічне дослідження готових забарвлених препаратів культур бактерій, що належать до різних морфологічних груп.

2. Вивчення морфології актиноміцетів.

Методичні вказівки

1. Переглянути фіксовані забарвлені препарати представників таких груп мікроорганізмів: коків (родів Micrococcus, Streptococcus, Sarcina), паличкоподібних бактерій (родів Bacillus, Pseudomonas), звивистих (родів Rhodospirillum, Vibrio), галузистих бактерій (родів Mycobacterium, Nocardia, Streptomyces).

Усі переглянуті препарати подати у вигляді рисунків.

2. Для вивчення актиноміцетів студенти одержують посіви ґрунтових зразків на чашках Петрі. Вивчаються колонії актиноміцетів, вирощені на крохмале-аміачному агарі (КАА). Описують і роблять рисунки різних типів колоній актиноміцетів. Результати спостережень заносять до таблиці:

Зовнішній вигляд колоній актиноміцетів на КАА

Колонія	Розмір	Поверхня	Колір міцелію	Виділення пігменту в середовище	Рисунок колонії

Матеріали, обладнання, реактиви

Готові забарвлені препарати різних морфологічних груп мікроорганізмів, культури актиноміцетів, вирощених на чашках Петрі; мікроскоп МБІ-1, імерсійна олія.

Тема 4. Будова прокаріотичної клітини. Поверхневі структури прокаріотів

Запитання для обговорення

1. Відмінності в організації та функціонуванні прокаріотичної та еукаріотичної клітин.

2. Клітинна стінка грампозитивних та грамнегативних бактерій. Метод Грама.

3. Цитоплазматична мембрана та її функції.

4. Капсула, слизові чохли.

5. Джгутики, пілі, простеки, шипи.

Самостійна робота

1. Приготування на одному склі мазків із культур Staphylococcus aureus, Escherichia coli та їх суміші. Засвоєння методу фарбування за Грамом.

2. Мікроскопічне дослідження готових препаратів різних структур бактеріальної клітини: капсули, клітинної стінки, джгутиків.

3. Вивчення рухливості бактерій за допомогою приготування препаратів “роздавлена крапля”, “висяча крапля”.

Методичні вказівки

1. У ході виконання даної роботи на одному склі потрібно приготувати всі три мазки на відстані приблизно1 см один від одного та одночасно забарвити їх за методом Грама.

Слід зазначити, що метод є найбільш універсальним із усіх складних способів фарбування. Він має важливе діагностичне значення, бо є одним із критеріїв установлення виду бактерій. Усі бактерії за цим методом розподіляють на дві групи: грампозитивні та грамнегативні. Грампозитивні утримують комплекс генціанового фіолетового з йодом під час обробки препарату спиртом, і тому забарвлюються в синьо-фіолетовий колір. Грамнегативні бактерії не мають такої здатності й знебарвлюються спиртом. У процесі наступної обробки фуксином чи сафраніном вони набувають рожево-червоного кольору.

Для засвоєння фарбування за Грамом, на одному знежиреному предметному склі роблять мазки різних мікроорганізмів: у центрі – мазок суміші грампозитивних і грамнегативних бактерій, по краях – контрольних культур. Клітини однієї контрольної культури повинні бути грампозитивними (наприклад, Staphylococcus aureus), другої – грамнегативними (наприклад, Escherichia coli). Мазки слід робити тонкими, щоб клітини рівномірно розподілялись на поверхні скла й не утворювали скупчень. Препарати висушують на повітрі, фіксують над полум’ям пальника та фарбують упродовж 1 – 2 хв карболовим генціановим чи кристалічним фіолетовим. Потім фарбу зливають і, не промиваючи мазок водою, обробляють його 1-2 хв розчином Люголя до почорніння. Зливають розчин Люголя, знебарвлюють 0,5 – 1,0 хв 90°-им етиловим спиртом, струшуючи, швидко промивають водою та додатково фарбують 1-2 хв водним фуксином. Барвник зливають, препарат промивають водою, висушують і мікроскопують із імерсійною системою. У разі правильного забарвлення грампозитивні бактерії (S. aureus) мають синьо-фіолетовий колір, а грамнегативні (E. coli) – рожево-червоний колір. За Грамом фарбують клітини молодих (18 – 24 годинних) культур, тому що здатність утримувати барвник залежить від фізіологічного стану бактерій.

2. Деякі види бактерій виробляють слизову речовину, яка концентруючись навколо тіла мікробної клітини, утворює капсулу. У разі звичайних методів фарбування капсула залишається безбарвною. Для виявлення капсул застосовують спеціальні методи фарбування (наприклад Бурі-Гінса). Студенти мікроскопують препарат Bacillus anthracoides, приготований за методом Бурі-Гінса. Звертають увагу на безбарвну капсулу навколо тіла бактеріальної клітини, яке забарвлене в червоно-рожевий колір фуксином. Темний фон, на якому видно клітини, створюється за рахунок туші.

3. Метод вивчення мікробів у живому незафарбованому стані має таку перевагу, що ми можемо спостерігати в них різноманітні процеси: рухливість, ріст, ділення, спороутворення, проростання спор.

Для цього готують препарати “роздавленої” та “висячої краплі”.

“Роздавлена крапля”: на предметне скло наносять піпеткою краплю культури й накривають її склом. Бажано, щоб при цьому не утворювалися бульбашки повітря, які заважають вивченню препарату під мікроскопом.

“Висяча крапля”: використовують спеціальне скло з луночкою, покривне скло, вазелін. Край луночки вкривають невеликим шаром вазеліну. На накривне скло наносять краплю бульйонної культури, потім обережно склом із луночкою накривають скло так, щоб крапля опинилась у центрі. Виходить герметично закрита камера. Предметне скло швидко перевертають уверх накривним склом. Крапля повинна вільно звисати в заглиблення, не торкаючись його дна та країв.

Для вивчення мікроорганізмів у живому стані використовують сухі системи (об’єктиви зі збільшенням у 8 і 40 разів), увігнуте дзеркало, трохи опущений конденсор і злегка прикриту діафрагму.

Рухливість у більшості мікроорганізмів обумовлена наявністю джгутиків. Їх розташування та кількість у різних бактерій неоднакова й має діагностичне значення, особливо під час ідентифікації паличкоподібних грамнегативних бактерій. За характером руху бактерій у препараті можна визначити тип джгутикування. Якщо джгутики розміщені на одному чи двох полюсах клітини, то рухаються вони дуже швидко, наче угвинчуються, без коливань із боку в бік; під час латерального чи перитрихіального розташування джгутики клітини рухаються плавно, здійснюючи коливання відносно осі руху. Окремий бактеріальний джгутик настільки тонкий, що його не можна побачити у світловому мікроскопі, якщо його не пофарбувати за спеціальним методом, який дозволяє збільшити видиму товщину джгутика. Так, діаметр окремих джгутиків коливається від 0,01 до 0,02 мкм (у Bdellovibrio – 0,04 – 0,06 мкм), а найбільша роздільна відстань світлового мікроскопа – 0,2 мкм. Лише в деяких бактерій, наприклад, у представників Spirillum, пучки джгутиків можна виявити під час спостереження на світловому полі за допомогою фазового контрасту чи на темному полі.

Матеріали, обладнання, реактиви

Живі культури, Staphylococcus aureus, E. coli, барвники та реактиви для фарбування за Грамом (генціановий фіолетовий, розчин Люголя, 96°-ний етанол, фуксин), предметні скельця, фільтрувальний папір, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, предметне скельце з луночкою, накривне скло, вазелін, імерсійна олія, мікроскоп МБІ-1, готові пофарбовані препарати різних поверхневих структур бактеріальної клітини: капсули, клітинної стінки, джгутиків.

Тема 5. Особливості внутрішньої структури бактеріальної клітини. Цитоплазма, її органели та включення

Запитання для обговорення

1. Організація генетичного апарату бактерій.

2. Рибосоми прокаріотів.

3. Включення бактеріальної клітини.

4. Типи диференціювання бактерій: ендоспори, екзоспори, цисти.

Самостійна робота

1. Мікроскопічне вивчення готових препаратів нуклеоїду бактерій.

2. Приготування препаратів ендоспор бактерій із різних культур спороутворюючих мікроорганізмів – Bacillus subtilis, Clostridium sp. (із ґрунтової витяжки).

3. Приготування препаратів запасних поживних речовин – гранульози, із культури Clostridium butyricum, жироподібних речовин у клітинах Bacillus megaterium, волютину в клітинах Bacillus subtilis.

Методичні вказівки

1. Виявлення нуклеоїду в бактеріальній клітині за допомогою світлового мікроскопа є досить складним. Лужні фарби, які вибірково забарвлюють хроматин еукаріотичних клітин, рівномірно та інтенсивно забарвлюють усю прокаріотичну клітину. Базофільні властивості бактеріальної клітини обумовлені наявністю в ній великої кількості рибосом, які створюють високу концентрацію РНК у цитоплазмі. У зв’язку з цим для вибіркового фарбування нуклеоїду фіксовані клітини завчасно обробляють рибонуклеазою чи розбавленою соляною кислотою, щоб зруйнувати рибосомальну РНК. Подальше фарбування лужною фарбою дозволяє виявити нуклеоїд у вигляді щільних тіл, які мають неправильну форму й розміщені в центрі чи на полюсах клітини. Під час фарбування за Романовським ядерні елементи мають червоно-фіолетовий колір, протоплазма – блідо-рожевий.

2. До спороутворення здатні грампозитивні бактерії в основному родів Bacillus, Clostridium тощо. Для виявлення здатності клітин до спороутоврення краще використовувати старі культури. Спори можна виявити, вивчаючи живі клітини, а також шляхом диференційного фарбування фіксованих препаратів. У разі виявлення в мікроорганізмів здатності до утворення спор необхідно звернути увагу на тип спороутворення – бацилярний, клостридіальний, плектридіальний; розміщення спори в клітині – центральне, ексцентральне або полярне; форму вільних спор – кругла, овальна чи продовгувата, визначення їх розмірів. Ендоспори мають багатошарові, важкопроникні оболонки, тому під час простої обробки препарату спороутворюючих бактерій фуксином чи генціанфіолетовим спори не фарбуються. Їх виявляють у клітині у вигляді включень, а вільні спори – у вигляді кілець.

3. Багато мікроорганізмів за певних умов культивування утворюють запасні речовини, які виявляються в клітині у вигляді гранулярних цитоплазматичних включень. Природа запасних речовин різноманітна. Частіше – це полісахариди, ліпіди, поліфосфати. Вуглеводні гранули природи виявляються в процесі обробки клітин розчином Люголя. Для цього до краплі суспензії клітин на предметному склі додають розчин Люголя. Препарат накривають склом і мікроскопують (обיєктив ×40). Гранули гранульози фарбуються у синій колір.

Ряд аеробних бактерій утворюють включення полі-бета-оксимасляної кислоти (ПОМ) як резервні ліпіди в умовах нестачі азоту й надлишку вуглецю. Гранули ПОМ виявляються у ході обробки клітин ліпофільними фарбами – суданом ІІІ або суданом чорним. Жири в клітинах бактерій мають вигляд маленьких крапель, нерівномірно розподілених у цитоплазмі.

У клітинах прокаріотів запасні речовини поліфосфатної природи (волютин) локалізовані в цитоплазмі. Фарбування волютинових гранул засноване на властивості метахромазії – здатності викликати зміну кольору деяких фарб (метиленовий синій). На препараті зерна волютину забарвлені в чорний колір, цитоплазма – у світло-коричневий. Волютинові зерна гарно виражені в клітинах азотобактера, сінної палички, молочнокислих бактерій, збудника дифтерії, дріжджів.

Зробити рисунки всіх розглянутих препаратів.

Матеріали, обладнання, реактиви

Жива культура Bacillus subtilis, Clostridium butyricum, Bacillus megaterium, предметні скельця, фільтрувальний папір, бактеріологічна петля, фізіологічний розчин, фарби та реактиви для виявлення включень, імерсійна олія, мікроскоп МБІ-1, готові пофарбовані препарати нуклеоїду бактерій.

Тема 6. Фізіологія мікроорганізмів. Особливості живлення бактерій.

Запитання для обговорення

1. Способи існування прокаріотів: джерела енергії, донори та акцептори, джерела вуглецю.

2. Типи живлення мікроорганізмів, харчові потреби, фактори росту.

3. Механізм надходження поживних речовин у бактеріальну клітину.

4. Методи виділення чистих культур аеробних бактерій.

Самостійна робота

1. Приготування живильних середовищ (МПА).

2. Освоєння техніки пересіву чистих культур на рідкі та тверді живильні середовища. Посів виснажуючим штрихом, газоном, уколом, посів на сектори.

3. Приготування мазків із суміші двох видів бактерій, забарвлення за Грамом, мікроскопія. Посів суміші культур методом виснажуючого штриха на чашку з МПА з метою отримання окремих колоній.

Методичні вказівки

1. Живлення є важливою функцією мікроорганізмів, необхідною для їх росту та розмноження. Для культивування бактерій застосовують різні поживні середовища, які повинні мати в своєму складі всі необхідні поживні речовини, фактори росту, певну реакцію рН та бути обов’язково стерильними.

Студенти знайомляться з різними поживними середовищами, які можна класифікувати за складом на дві групи.

А. Натуральні середовища, що складаються з продуктів рослинного та тваринного походження. Це овочеві та фруктові соки, молоко, кінська сироватка, що зсілась, шматочки картоплі та моркви, приготовані в пробірках відвари, екстракти, одержані з природних субстратів.

До натуральних середовищ невизначеного складу належать м’ясо-пептонний агар, пептонний бульйон, дріжджове та картопляне середовища, ґрунтова витяжка, а також напівсинтетичні середовища: МПБ із 2%-им розчином глюкози, дріжджевий автолізат і солі амонію та вуглеводи в певній кількості.

Б. Синтетичні середовища, до складу яких входять тільки певні хімічно чисті сполуки, в точно вказаних концентраціях: середовище Виноградського для нітрифікуючих бактерій.

За призначенням розрізняють: селективні середовища, які забезпечують переважаючий розвиток одного виду чи групи мікроорганізмів – це середовище Чапека (для актиноміцетів), Врублевського, Кітта-Тароцці (для анаеробів), МПА з новобіоцином (для сапрофітних стафілококів, стійких до новобіоцину) та диференційно-діагностичні (індикаторні) середовища, які дозволяють достатньо відрізнити одні види мікроорганізмів від інших – це середовище Ендо (для кишкових бактерій), вуглеводні середовища, до складу яких входять різні вуглеводи з індикатором.

За фізичним станом середовища поділяють на рідкі (МПБ), тверді (МПА) та сипучі (розварене пшоно, висівки).

2. Студенти засвоюють правила роботи з чистими культурами мікроорганізмів, методи культивування.

Викладач ознайомлює студентів із основними мікробіологічними термінами: посів чи інокуляція – внесення клітин мікроорганізмів у стерильне середовище; поняттями: чиста культура, штам, клон; із основним посудом, що використовується для вирощування мікроорганізмів на твердих та рідких середовищах (чашки Петрі, колби тощо).

Студенти під контролем викладача засвоюють техніку пересіву чистих культур на тверді та рідкі поживні середовища.

Для посіву чи приготування препаратів клітини мікроорганізмів беруть бактеріологічною петлею, якщо культура вирощена на твердому поживному середовищі, та використовують стерильні піпетки для вирощування мікроорганізмів у рідкому середовищі.

Пробірку з культурою беруть у ліву руку так, щоб поверхня живильного середовища з нальотом мікроорганізмів була повернена догори й трохи нахилена. У праву руку беруть петлю, прожарюють у полум’ї пальника. Потім, не випускаючи петлі, мізинцем та безіменним пальцем правої руки притискають зовнішній кінець ватяної пробки до долоні й виймають пробку з пробірки.

Краї відкритої пробірки прожарюють у полумיї пальника, вводять у пробірку стерильну петлю та, відібравши невелику кількість мікробної маси, обпаляюють внутрішній кінець ватяної пробки й закривають нею пробірку. Відібраний матеріал використовують для приготування препарату чи пересіву на свіже середовище. Клітини мікроорганізмів, які залишаються на петлі, спалюють.

Клітини мікроорганізмів, які виросли на рідкому середовищі, збирають стерильною піпеткою, рідко – петлею. Для цього піпетку виймають із паперу, в якому вона стерилізувалась, тримаючи за верхній кінець середнім та великим пальцями правої руки. У ліву руку беруть пробірку (колбу) з рідким середовищем, відкривають, як описано вище, та вводять у неї піпетку. Відібравши частину середовища, закривають пробірку (колбу) й використовують взяту пробу для приготування препарату чи посіву на свіже поживне середовище. Після цього піпетку негайно занурюють у дезінфікуючий розчин (0,5-3%-ий водяний розчин хлораміну чи 3-5%-ий водяний розчин фенолу), не торкаючись нею навколишніх предметів.

Пересіваючи клітини мікроорганізмів із одного середовища на інше, в ліву руку зручно взяти дві пробірки: одну зі стерильним середовищем (далі від себе), іншу – з культурою мікроорганізмів (ближче до себе), а в праву руку – бактеріологічну петлю. Стерилізують петлю в полум’ї пальника, потім, притиснувши пробки двох пробірок до долоні мізинцем та безіменним пальцями правої руки, відкривають пробірки. Бактеріологічною петлею відбирають клітини мікроорганізмів і вводять петлю в пробірку зі стерильним скошеним агаром майже до дна. Ледь торкаючись петлею поверхні агару, проводять знизу вгори зигзагоподібну чи пряму лінію – штрих. Посів голкою проводять у такій же послідовності, як і посів петлею, з тією лише різницею, що в товщу агаризованого середовища роблять укол.

Якщо посів проводять у рідке середовище, то пробірки тримають майже вертикально, щоб не замочити пробки. Петлю з мікроорганізмами занурюють безпосередньо в середовище.

Усі описані вище маніпуляції здійснюють біля полум’я пальника якнайшвидше, щоб не забруднити культуру сторонніми мікроорганізмами.

Студенти самостійно проводять пересіви чистих культур бактерій на скошений агар. Необхідно слідкувати за тим, щоб під час цього петля не пошкоджувала поверхню середовища. Результати пересівів переглядають на наступному занятті.

3. Кожен студент одержує під відповідним номером заздалегідь приготовану суміш із двох видів бактерій. Із суміші готують мазок, забарвлюють за Грамом і розглядають під мікроскопом.

Якщо препарат приготований правильно, в кожній суміші виявляються бактерії двох видів, наприклад, стафілокок (Гр+) і кишкова паличка (Гр-), сінна паличка (Гр+) і вібріон (Гр-), тобто один із них забарвлюється за Грамом позитивно, інший – негативно. Потім суміш бактерій за допомогою петлі розсівається по поверхні мיясо-пептонного агару, завчасно розлитого в чашки Петрі. На петлю необхідно брати трохи матеріалу, її вушко не повинне бути заповнене рідиною. Посів проводять паралельними штрихами по всій поверхні середовища на відстані 0,5 см між ними. Чашки підписують і вміщують у термостат.

Матеріали, обладнання, реактиви

Культури: суміш культур Гр+ і Гр- мікроорганізмів; бактеріологічна петля, чашки з МПА, пробірки з МПБ, агарові стовпчики, предметні скельця, мікроскоп МБІ-1, імерсійна олія, фільтрувальний папір, дистильована вода, фарби.

Тема 7. Фізіологія росту та розмноження бактерій. Культуральні властивості мікроорганізмів.

Запитання для обговорення

1. Поняття періодичної та неперервної культури.

2. Параметри росту бактеріальної культури.

3. Вплив фізичних і хімічних факторів на мікроорганізми. Умови культивування.

Самостійна робота

1. Визначення деяких параметрів росту мікроорганізмів під час періодичного культивування.

2. Наступний етап виділення чистих культур із суміші: вивчення культуральних властивостей окремих видів бактерій.

3. Приготування мазків із різних типів колоній, забарвлення за Грамом, мікроскопія.

4. Пересів вивчених колоній на пробірки зі скошеним агаром для виділення чистої культури.

Методичні вказівки

1. Ріст мікроорганізмів у ході періодичного культивування відбувається в закритих системах, у які всі компоненти вносять на початку процесу й потім не додають. Склад середовища, концентрація біомаси та метаболітів увесь час змінюється в результаті залучення цих компонентів у метаболізм клітин. У процесі культивування спостерігаються чотири головні фази росту: лаг-фаза, лог-фаза, стаціонарна та фаза відмирання. Таким чином, у бактеріальній популяції постійно відбуваються ріст бактерій, їх розмноження та відмирання.

Спостерігаючи за розвитком бактеріальної популяції, звертають увагу перш за все на кількість клітин (біомаса) в одиниці обיєму, їх життєздатність, швидкість росту, час подвоєння біомаси.

Дата добавления: 2017-02-01