Методы исследования активности ферментов

В отличие от других биохимических показателей, концентрацию большинства ферментов нельзя определить, т.к. их содержание в биоматериале очень мало. О количестве фермента судят косвенно, по его активности, т.е. по производимому ферментом действию. Активность фермента выражается скоростью уменьшения субстрата, или увеличения продукта реакции (изменение концентрации в единицу времени) в пересчете на количество материала, содержащего фермент. Для определения активности ферментов чаще используют колориметрические и спектрофотометрические методы. Колориметрические методы основаны на измерении оптической плотности окрашенного вещества, образующегося с субстратом или продуктом ферментативной реакции, как правило, после остановки реакции. По способу измерения колориметрические методы являются методами – «по конечной точке» (однократное измерение). Спектрофотометрические методы основаны на измерении изменения поглощения света определенной длины волны субстратом и продуктом реакции. Большинство спектрофотометрических методов определения активности ферментов основано на оптическом тесте Варбурга. Принцип прямого теста Варбурга: при длине волны 340нм восстановленный (НАДН2) имеет максимальное поглощение, а окисленный (НАД) – минимальное, например, Лактат + НАД → ПВК + НАДН₂ (оптическая плотность увеличивается). Используется для определения активности НАД-зависимых дегидрогеназ. Непрямой тест Варбурга используется для определения активности других ферментов и включает измерительную и индикаторную реакции:

Ала + α-кетоглу → глу + ПВК – измерительная реакция

ПВК + НАДН₂ → Лактат + НАД - индикаторная реакция

По способу измерения спектрофотометрические методы могут быть: непрерывные кинетические (определяется изменение оптической плотности субстрата или продукта в единицу времени), двухточечное измерение (определяется изменение оптической плотности субстрата или продукта реакции в начале и в конце ферментативной реакции), по конечной точке.

Дата добавления: 2013-12-13