Окраска спор у бактерий

Вводные пояснения. Споры бактерий по сравнению с вегетативными клетками обладают высокой устойчивостью к неблагоприятным условиям внешней среды. Они представляют собой округлые, овальные или эллипсовидные образования. Если диаметр споры не превышает диаметра клетки, в которой спора образуется, клетку называют бациллярной, если превышает, то в зависимости от расположения споры в центре или на конце клетки эту клетку называют соответственно клостридиальной или плектридиальной.. В бациллярной клетке спора может размешаться в центре клетки — центральное положение, на конце — терминальное и ближе к одному из концов — субтерминальное положение.

При наблюдении за живыми спорообразующими бактериями их споры можно различить по более сильному преломлению световых лучей. Споры кислотоустойчивы, поэтому с трудом окрашиваются красителями. Объясняется это большой плотностью оболочки, низкой концентрацией в ней свободной воды и высоким содержанием липидов в спорах. В препаратах, окрашенных простыми способами или по Граму, споры остаются бесцветными (негативная окраска).

В связи с особенностями физико-химического состава и плотной малопроницаемой оболочкой на первом этапе окраски спор применяют химические вещества, изменяющие структуру их оболочки. Однако при последующем прокрашивании споры одновременно прокрашивается и цитоплазма клетки, поэтому под микроскопом последняя выглядит однородно окрашенной. Для того чтобы на препарате оставались прокрашенными только споры, следует такой «перекрашенный» препарат частично обесцветить, забирая краситель у цитоплазмы и оставляя его в споре. Этого достигнуть нетрудно, так как краситель, адсорбированный спорой, удерживается прочнее, чем поглощенный цитоплазмой клетки.

Таким образом, все способы окраски спор основаны на едином принципе: сначала споры протравливают различными веществами: хромовой, соляной, серной, уксусной кислотами, аммиаком, едким натром или перекисью водорода, затем окрашивают клетку со спорой при нагревании и, наконец, обесцвечивают цитоплазму и дополнительно окрашивают ее контрастным красителем.

Метод Циля—Нильсена в модификации Мюллера. Мюллер, модифицировав известный метод Циля—Нильсена, применяемый обычно для выявления кислотоустойчивости бактерий (дифференциальной окраски микобактерий и некоторых близких к ним микроорганизмов), снизанной с особенностями химического состава их оболочки, предложил использовать его для окраски спор бактерий.

До фиксации мажа бактерий на пламени препарат готовят обычным способом (см. 2.2.1). Далее на фиксированный в пламени и остывший препарат наносят 5%-ный раствор хромовой кислоты. Через 5—10 мин ее смывают водой. Препарат накрывают полоской фильтровальной бумаги и обильно смачивают бумагу карболовым фуксином Циля. Подогревают препарат над пламенем до появления паров (не до кипения), затем отводят его в сторону и добавляют новую порцию красителя. Эту процедуру проводят в течение 7 мин. Важно, чтобы краситель испарялся, но бумага не подсыхала. После охлаждения ее снимают, препарат промывают водой и тщательно промокают фильтровальной бумагой. В результате такой обработки клетки со спорами равномерно прокрашиваются.

Далее обесцвечивают цитоплазму клеток (но не споры), обрабатывая 1%-ным раствором соляной или серной кислот в течение 15—30 с. При приготовлении препарата спор Bacillus mycoides или Bacillus mesentericus рекомендуется обесцвечивать цитоплазму 16—18 с (размеренно считая вслух от 21 до 37—40). При превышении этого времени могут обесцветиться и споры. Затем препарат промывают водой и окрашивают метиленовым синим 2 мин.

Если все операции проделаны правильно, окраска получается контрастной и ярко-красные споры четко выделяются на голубом фоне цитоплазмы.

Метод Пешкова. На фиксированный в пламени препарат наливают метиленовый синий Леффлера, доводят его до кипения и кипятят 15—20 с, держа стекло над пламенем. Мазок промывают водой и докрашивают в течение 30 с 0,5%-ным водным раствором нейтрального красного. Еще раз промывают, подсушивают и далее исследуют препарат с масляной иммерсией объектива. Споры окрашиваются в голубой или синий цвета, цитоплазма — в розовый.

Для исследования спор удобными объектами могут служить Bacillus mesentericus или Bacillus mycoides в возрасте 4 сут.

Реактивы для окрашивания спор бактерий.

1. Карболовый фуксин Циля (см. 3.2.2).

2. Метиленовый синий Леффлера (см. 3.2.2).

3. Насыщенный водный раствор метиленового синего 2 г красителя и 100 мл дистиллированной воды.

4. Хромовая кислота, 5%-ный раствор.

5. Соляная (или серная) кислота, 1%-ный раствор.

Дата добавления: 2014-01-04