Окраска жгутиков

Окраска капсул

Некоторые виды бактерий образуют слизистые капсулы. При обычных методах окраски они остаются бесцветными. Для выявления их применяют специальные негативные методы окраски, например метод Бурри. Метод заключается в следующем.

Каплю туши помещают на хорошо обезжиренное смесью спирта с эфиром предметное стекло и смешивают с каплей жидкости, содержащей бактерии. При помощи покровного стекла распределяют мазок тонким слоем по поверхности предметного стекла. После того как препарат высохнет на воздухе, его рассматривают с иммерсионной системой. На дымчато-темном фоне ясно видны неокрашенные капсулы и клетки бактерий.

Для исследования капсул наиболее удобны клетки азотобактера.

Приготовление туши. Одну часть туши смешивают с девятью частями дистиллированной воды и стерилизуют при 1 атм 30 мин в пробирках, закрытых ватными пробками. Вместо стерилизации можно добавлять к туши несколько капель формалина. Подготовленную таким образом тушь выдерживают две недели, пока все измученные частицы не осядут на дно. Для приготовления препарата осторожно берут только верхнюю часть отстоявшейся жидкости.

Вводные пояснения. Жгутики микроорганизмов — тончайшие образования (0,02—0,04 мкм), легко отрывающиеся от клетки при обработке. Это затрудняет их исследование. В основе методов окрашивания жгутиков лежит обработка их протравителями, в результате которой они увеличиваются в объеме.

Подготовка материала. Для подготовки культуры рекомендуется, ежедневно несколько дней подряд делать пересевы на свежую питательную среду (в жидкую среду или в конденсационную воду свежей скошенной агаризованной среды). В день просмотра материал берут петлей и переносят в пробирку с 5—6 мл стерильной водопроводной воды, нагретой до 37°С. Не рекомендуется, размешивать бактериальную массу в воде петлей, она сама должна разойтись в ней в течение 30-60 мин.

Прежде чем приступать к работе, необходимо проверить подвижность клеток в висячей капле. В случае отсутствия подвижности пробирку оставляют в термостате на 1 1/2—2 сут.

Для приготовления препаратов необходимы абсолютно чистые предметные стекла. Их кипятят в растворе бихромата калия в крепкой серной кислоте, затем дважды промывают в растворе едкого натра. После этого стекла промывают водой и хранят в банке 96%-ным спиртом. Затем ту сторону стекла, на которую будет нанесен мазок, сильно нагревают и охлаждают.

Метод Леффлера. Суспензию 12—16-часовой культуры

бактерий наносят на предметное стекло и сушат при комнатной температуре. Допустимо зафиксировать мазок, быстро проведя его через пламя. Далее препарат обрабатывают протравителем 3—5 мин, нагревая его до появления паров или в течение 15—20 мин при комнатной температуре, затем промывают сильной струей дистиллированной воды 30 с и высушивают на воздухе.

Окрашивают препарат 3—4 мин карболовым фуксином Циля или раствором, содержащим 1 часть насыщенного спиртового раствора фуксина и 10 частей воды при легком нагревании до появления пара. Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют под микроскопом с иммерсией. Жгутики и клетки бактерий окрашиваются в розовый цвет.

Приготовление протравителя. 12 г таннина растворяют при нагревании в 48 мл воды, добавляют 30 мл насыщенною водного раствора железного купороса (FeSO₄) и 6 мл насыщенного раствора фуксина в 96%-ном спирте. Смесь готовят за несколько дней до употребления, хранят в склянке с притертой пробкой в темном месте. Перед началом работы ее фильтруют.

Метод Лейфсона. Стеклографом на одной половине стекла по границе вычерчивают прямоугольник. На плошадь прямоугольника петлей наносят суспензию бактерий. Наклоняя стекло, дают возможность стечь избытку жидкости на противоположную сторону стекла. Препарат сушат при комнатной температуре на воздухе.

На мазок наносят точно 1 мл парарозанилинового красителя, следя за тем, чтобы он не растекался за нанесенные на стекло линии. Поскольку в красителе содержится танниновая кислота, предварительной фиксации не требуется. Окрашивание длится 7—15 мин (время определяют в каждом конкретном случае экспериментально). Для уточнения правильности срока окраски препарат помешают на черный фон и освещают сбоку. Как только по всему мазку выпадет осадок, избыточный краситель удаляют слабой струей дистиллированной воды, не отмывая выпавший в осадок краситель. Если клетки бактерий не окрасились в красный цвет, их докрашивают метиленовым синим.

Приготовление парарозанилина. Для этого необходимы три раствора: первый— l,5%-ный NaCI в дистиллированной воде; второй— 3%-ный танниновой кислоты в дистиллированной воде (раствор должен быть светло-желтым); третий — 0,9%-ный парарозанилинацетата, или 0,3%-ный парарозанилингид-рохлорида в 96%-ном этиловом спирте. Для получения однородной смеси требуется несколько часов даже при взбалтывании. Вместо соли розанилина можно применить основной фуксин в виде 1,2%-ного раствора в 96%-ном этиловом спирте.

Для приготовления красителя смешивают равные объемы всех трех растворов, полученную смесь хранят в плотно закупоренной склянке. Краситель сохраняет свои свойства при 4°С несколько недель, а при t = -10—20°С — месяцы и даже годы.

Метод серебрения жгутиков по Морозову. Готовят три реактива. Состав первого: 1 мл ледяной уксусной кислоты, 2 мл формалина, 100 мл дистиллированной воды; состав второго: 5 г таннина, 1 мл жидкой карболовой кислоты (фенола), 100 мл дистиллированной воды; состав третьего: 5 г кристаллического нитрата серебра (AgNO₃), 100 мл дистиллированной воды.

К 80 мл раствора серебра по каплям приливают водный раствор аммиака (нашатырного спирта) до растворения образовавшегося осадка и появления легкой опалесценции. Если аммиака будет добавлено слишком много, то из оставшихся 20 мл раствора серебра следует добавить еше несколько капель до возникновения опалесценции.

Для окраски препарата полученный раствор серебра разводят дистиллированной водой в соотношении 1: 100.

Техника окраски следующая: на 1 мин на препарат наливают первый реактив, сливают его, промывают препарат водой; наливают второй реактив, препарат подогревают на слабом пламени 1 мин до появления паров, тщательно промывают водой; 1—2 мин при нагревании обрабатывают препарат третьим реактивом до появления темно-коричневой окраски мазка, тщательно промывают водой, высушивают и микроскопируют с иммерсией.

Дата добавления: 2014-01-04