Характеристика активных форм кислорода и анализ их взаимодействий в мясном сырье

В мышечной ткани содержатся различные компоненты, составляющие целую систему антиоксидантной защиты, которая представлена субстратом окисления, антиоксидантами и катализаторами окисления. Потенциал липидного окисления мяса определяется взаимодействием прооксидантов и антиоксидантов. При жизни в мышечной ткани животного окисление полностью контролируется антиоксидантной системой и поэтому предотвращается окислительная деструкция липидных мембран, белков, нуклеиновых кислот.

При производстве мясных продуктов сбалансированная окислительная система разрушается в процессе измельчения, посола и варки. При измельчении мяса происходит смешивание липидов и катализаторов окисления, которые могут контактировать с кислородом. Варка приводит к разрушению клеток мышечной ткани и денатурации белка, в результате которой снижается антиоксидантная активность ферментов, образуется белковосвязанное железо. Посол способствует повышению каталитической активности железа и уменьшению антиоксидантной активности ферментов.

Установлено, что перекисное окисление липидов мышечной ткани является нормальным физиологическим процессом, а пероксиды липидов – продуктами обмена метаболизирующих клеток. В липидном бислое мембран имеются все условия, необходимые для гомогенного цепного окисления в жидкой фазе. Безусловно, строение биомембран должно существенно влиять на интенсивность этого процесса. Контроль скорости элементарных реакций окисления осуществляется и через работу ферментов и химическим путем. Следует особо отметить, что непосредственно реагировать с перекисными радикалами липидов, ведущими цепь окисления, способны только природные антиоксиданты (АО). Показано, что в липидах присутствуют две формы АО - активно взаимодействующая с перекисными радикалами (К_инг =10⁵÷10⁶ М^-1с^-1) и в 100-1000 раз менее эффективная (К_инг = 10²÷10³ М^-1с^-1). Авторы считают, что высокоэффективными ингибиторами являются фенольные формы АО или вещества, имеющие активные атомы водорода. Менее активны хиноны, реагирующие преимущественно с алкильными радикалами. В липидном бислое мембран, по всей вероятности, существует равновесие фенол ↔ феноксил↔ хинон, которое может выполнять регуляторную роль для быстрого перехода из активной формы в пассивную [25].

В любом живом организме существует взаимосвязь в соотношении и регуляции ферментных систем генерации и элиминации реакционноспособных интермедиатов кислорода и ксенобиотиков (НАДФН-оксидаза, СОД, каталаза, глутатионпероксидаза, NO-синтаза и др.), которая способствует формированию «антиоксидантного статуса» организма [10,12]. У животных высокий «антиоксидантный статус» можно поддерживать кормлением специальными рационами, содержащими, например, антиоксиданты. Так, добавление витамина Е в рацион свиней, цыплят и индеек приводит к увеличению содержания витамина в мышцах и повышению устойчивости липидов мяса этих животных к окислению.

В мясных продуктах в процессе переработки жирные кислоты взаимодействуют с кислородом. В мышцах происходит окисление липидной мембраны, на которое влияет концентрация кислорода. Снизить ее можно с помощью оборудования, обеспечивающего переработку в вакууме или в модифицированной атмосфере, а также упаковыванием готового продукта в вакууме в полимерный материал.

Антиоксидантная система сырья животного происхождения включает в себя низкомолекулярные вещества, ферменты и клеточные вещества (табл. 1). Они контролируют действие прооксидантов, связывают свободные радикалы и дисмутируют реактивные виды кислорода. Из низкомолекулярных антиоксидантов a-токоферол занимает основное место. В результате взаимодействия с кислородными радикалами образуется токоферилхиноновое соединение.

Каротиноиды, входящие в состав липопротеинов крови, играют роль физиологических перехватчиков гипохлорита и пероксинитрита, предохраняя, таким образом, липопротеины от окислительной модификации. Основное их свойство инактивировать реактивные виды кислорода. Но так как синглетный кислород не является главным прооксидантом, то каратиноиды имеют ограниченное участие в снижении окислительной способности мясных продуктов (Faustman, 1993).

Таблица 1 – Тушители активного кислорода и свободных радикалов, антиоксиданты и их функции (по Болдыреву А.А.,1998)
Антиоксиданты	Локализация	Функция
Ферменты и белки
СОД:
Cu/Zn-СОД	Эритроциты, цитоплазма	Тушение О2^•‾
Mn-СОД	Митохондрии	Тушение О2^•‾
Se-СОД	Плазма крови, стенки сосудов	Тушение О2^•‾
Каталаза	Пероксисомы	Тушение Н2О2
Глутатион-пероксидаза	Цитоплазма, митохондрии	Деградация Н2О2 и пероксидов липидов
Глутатион-трансфераза	Клеточные мембраны, цитоплазма, митохондрии, эндоплазматический ретикулум	Деградация Н2О2 и пероксидов липидов
Ферритин	Цитоплазма	Хелатор Fe^2+
Трансферрин	Внеклеточная жидкость	Хелатор Fe^2+
Лактоферрин	Внеклеточная жидкость	Хелатор Fe^2+
Церулоплазмин	Внеклеточная жидкость	Хелатор Cu^2+, окисление Fe^2+, тушение О2^•‾
Альбумин	Внеклеточная жидкость	Хелатор Cu^2+, тушитель ОН^•, LOO^•, HOCl т.п.
Низкомолекулярные соединения
Витамин Е	Биомембраны	Тушение ОН^•, LOO^•, HOCl т.п.
Убихинол	Биомембраны	Тушение ОН^•, LOO^•, HOCl т.п.
Каротиноид	Биомембраны	Тушение ОН^•, LOO^•, HOCl, ^1О2
Витамин С	Цитоплазма	Тушение ОН^•, О2^•‾
Глутатион	Цитоплазма, митохондрии	Тушение ОН^•, О2^•‾
Мочевая кислота	Кровь	Предотвращение пероксидного окисления липидов
Билирубин	Кровь	Предотвращение пероксидного окисления липидов
Карнозин	Мышечная ткань	Предотвращение пероксидного окисления липидов, тушение ОН^•,^1О2, HOCl, О2^•‾

Токоферолы и каротиноиды, содержание которых зависит от типа кормления, а также степени окислительного стресса в мышцах животных, не являются определяющими антиоксидантами окисления липидов. Показано, что причины противоречий по распределению веществ, принадлежащих к группе соединений, структурно родственных токоферолу или убихинону по значениям константы перекисного радикала субстрата, возникают в недооценке процесса окисления, а также в использовании различных концентрационных и временных диапазонов. По значениям константы перекисного радикала k₇10⁴ (М^-1с^-1) при температуре 50^оС исследованные соединения можно расположить в ряд: токоферилгидрохинон > токоферол > убихинол > убихроменол > токоферилхинон ≈ убихинон [10].

Клеточным антиоксидантом является аскорбиновая кислота. В зависимости от концентрации, она либо задерживает, либо ускоряет окисление. В низких концентрациях она ускоряет окисление липидов, снижая количество железа в активном состоянии. Высокие концентрации ее ингибируют липидное окисление, инактивируя свободные радикалы.

Анализ биохимических процессов в мясе при его ферментации стартовыми культурами, показал, что развитие окислительных процессов в мясном сырье зависит от активности антиоксидантной системы мышечной ткани после убоя, последующих технологических операций (посол, измельчение), условий окружающей среды (свет, кислород, температура, рН) интенсивности биохимических изменений основных компонентов, а также участия в них стартовых культур и их антиоксидантной активности.

Антиоксидантная система мясного сырья включает в себя ферменты и низкомолекулярные вещества. Они контролируют действие прооксидантов, связывают свободные радикалы и детоксицируют активные формы кислорода. На окисление липидов мяса и размножение микроорганизмов стартовых культур влияют активные формы кислорода: супероксильные анионы (О₂^•-), а также пероксид водорода, гидроксильный радикал (ОН^•) и нитроксил (NO^•). Активные формы кислорода действуют на окислительные процессы в мясе, а также на размножение в нем микроорганизмов стартовых культур. Анализ источников образования радикалов в мясе, способных вступать во взаимодействие с белками и липидами показал, что среди них главными являются супероксильные анионы.

Комплексное воздействие повреждающих радикалов может приводить к нарушению функционирования клеток микроорганизмов стартовых культур, изменению свойств мышечной ткани и окислению нуклеиновых кислот, белков и липидов (табл. 2).

Большое значение в функционировании скелетной мускулатуры имеет оксид азота (NO), на образование которого в мышечной ткани после убоя влияет физиологическое состояние животного перед убоем. Нитроксил (NO^•) − промежуточный продукт реакции нитрозообразования при ферментации мяса. Вместе с тем из-за высокой скорости проникновения через клеточную мембрану и относительно большой продолжительности жизни нитроксил рассматривают как фактор отрицательного воздействия на клетки молочнокислых микроорганизмов и другие виды стартовых культур. Изучено функциональное значение NO^• для клеток микроорганизмов в присутствии активных форм кислорода и установлено, что в общем виде оно сводится к взаимодействию супероксил-аниона с NO^• и образованием нерадикального соединения - пероксинитрита O^•ONO, сильного биологического окислителя и образующего в кислой среде гидроксил-радикал.

Таблица 2 – Основные радикалы и соединения кислорода, образующиеся в мясном сырье
Вещество	Источник образования	Негативное действие
Супероксил	Клеточный метаболит, образуется при автолизе; при измельчении, посоле мяса, под действием света, кислорода	Взаимодействие с белками, ДНК
Нитроксил	Компонент скелетной мускулатуры; образуется в процессе реакции нитрозообразования	Образование пероксинитрита NO^•+O2^•¯→ O^•ONO¯
Гидроксил- радикал	H2O2 + Fe^2+→ Fe^3++HO¯ +HO^•	Окисление биомембран
Пероксид водорода	О2^•- ^СОДН2О2	Окисление биомембран

Образование нитроксила в мышечных волокнах регулируется NO-синтазой. Физиологически эта активная форма кислорода вызывает расслабление мышечных волокон. Однако в условиях мышечного сокращения нитроксил вызывает мышечные повреждения в результате изменения радикальной активности, зависящей от присутствия супероксильных анионов. При низком содержании NO^• в мышцах инактивируются супероксилы, при высоком содержании NO^• и супероксилов - образуется пероксинитрит, способный разрушать структуру и целостность волокон, а также создавать окислительный стресс для МКМ. Оксид азота может функционировать как эффективный прооксидант, если он не удаляется супероксиддисмутазой. При взаимодействии пероксинитрита с мочевой кислотой и глутатионом образуются нитрозопроизводные, которые могут генерировать NO^• и приводить к образованию органического нитрозопероксикомплекса, участвующего в цепных реакциях перекисного окисления.

Автолитические изменения в мясном сырье сопровождаются накоплением супероксилов, нитроксила, пероксида водорода, гидроксил-радикалов, являющихся инициаторами окисления липидов. Вместе с ферментами и низкомолекулярными веществами мышечной ткани в предотвращении окисления существенную роль играют ферменты микроорганизмов стартовых культур. В связи с этим механизм взаимодействия клеток со свободными радикалами в мышечной ткани можно представить в следующем виде (рис. 11).

АФК и соединения кислорода извне попадают в клетку и могут или инактивироваться ферментами клетки (СОД, каталаза), или взаимодействовать с нитроксилом с образованием пероксинитрита. Взаимодействуя с низкомолекулярными тиолами, нитроксил образует моно-, динитрозильные комплексы, токсичные для клетки. В присутствии ионов Fe²⁺ гидроксил-радикалов инициируют образование продуктов окисления липидов. Когда генерация свободнорадикальных форм кислорода увеличивается больше, чем устойчивость антиоксидантной системы клетки, создаются условия, приводящие к ее гибели, в результате чего антиоксидантные ферменты могут метаболизировать супероксильные анионы или пероксид водорода.

Взаимодействие микроорганизмов с кислородом сопровождается образованием активных форм кислорода. При этом все клеточные компоненты- ДНК, белки и липиды, подвергаются повреждающему действию АФК. Антиоксидантная активность, важная при отборе штаммов промышленно ценных микроорганизмов, характеризует их способность выживать в условиях технологического процесса, а для пробиотических культур - в микробиоценозе желудочно-кишечного тракта.

Физиологическое понимание значения преодоления окислительного стресса, показанное [34, 46], позволяет рассматривать его как дополнительный метод ингибирования микробного роста при использовании стартовых культур в производстве и консервировании пищи. Основными компонентами ферментативной защиты клеток являются эндогенные ферменты - супероксиддисмутаза и каталаза

Под действием кислорода образуются потенциально опасные активные формы кислорода и полностью снижается доступность железа.

В восстановленной форме железо способно усиливать образование еще более токсичных гидроксил-радикала и ферильного железа. Супероксильный анион удаляет железо из содержащих его молекул в реакции Фентона. Оказывается, что строгой регуляции ассимиляции железа мешает избыток

внутриклеточного железа, что и приводит к окислительному стрессу у микроорганизмов [57].

Проявление антиоксидантных свойств зависит от содержания кислорода в ферментируемом субстрате [34], стадии роста микроорганизмов и генетически врожденной способности вырабатывать механизмы защиты от кислорода. Большинство культур, применяемых для производства пищевых продуктов, представляют собой микроаэрофилы. Известно, что лактобактерии и стрептококки синтезируют только Mn-CОД [29]. Данных о наличии у бифидобактерий супероксиддисмутазной активности в просмотренных нами источниках не обнаружено.

Установленным фактом можно считать способность микроорганизмов стартовых культур, а именно стафилококков предотвращать липидное окисление колбас каталазой. Максимальное ее образование отмечается у стафилококков в конце экспоненциальной фазы роста и варьирует у различных штаммов [58].

Данные об антиоксидантной активности касаются, главным образом, штаммов микроорганизмов применяемых в зарубежной практике и практически отсутствует информация об этих свойствах у штаммов, широко распространенных или рекомендуемых для производства пищевых продуктов.

Исходя из информации в научной и технической литературе о способности молочнокислых бактерий инактивировать супероксильные анионы и пероксид водорода, важные для понимания их роли в окислении липидов пищевых систем, была исследована СОД-активность некоторых штаммов, принадлежащих к различным таксонам. Данные представлены в табл.3.

В соответствии с методом определения значение СОД-активности стандартизируют по количеству белка, содержащегося в бактериях.

Таблица 3- Супероксиддисмутазная активность (СОД-акивность)

пробиотическиъх культур

Условное обозначение штамма	Вид микроорганизма	Наименование среды культивирования штамма	СОД –активность, ед/мг белка
	Bifidobacterium	ГМК	95,0 ± 0,1
	Bifidobacterium	ГМК	95,6± 0, 2
	Bifidobacterium	ГМК	53,9± 0,1
	Bifidobacterium	ГМК	100,8± 0,1
	Lactobacillus paracasei	Обезжиренное молоко	1,4± 0,1
	Lactobacillus paracasei	Обезжиренное молоко	1,7± 0,1
	Lactobacillus	Обезжиренное молоко	2,4± 0,2
	Lactobacillus rhamnosus	Обезжиренное молоко	1,3± 0,1

В результате исследований четырёх культур бифидобактерий: 668,672,676, 678 установлено, что каждый штамм проявляет высокую антиоксидантную активность в сравнении с информацией, имеющейся в литературных источниках. Выявленная супероксиддисмутазная активность культур бифидобактерий свидетельствует о том, что штаммы обладают выраженным антиоксидантным действием, которое может проявляться как в условиях in vitro, так и in vivo.

Полученные данные (табл.3) свидетельствуют о том, что изученные штаммы лактобацилл обладали невысокой СОД-активностью по сравнению с культурами бифидобактерий. Следует отметить, что биомасса всех культур лактобацилл была получена на обезжиренном молоке, и именно в этих образцах реакция определения белка, по которому оценивают СОД-активность была затруднена. Полагаем, это может быть связано с тем, что клетки бактерий образовали определенный комплекс с белками молока, что затрудняло отмывание клеток от питательной среды.

Считаем целесообразным, в дальнейших исследованиях при определении СОД-активности культур использовать биомассу штаммов микроорганизмов, получаемую на средах, содержащих минимальное количество белка.

Необходимо отметить также, что именно антиоксидантные ферменты имеют значение как для защиты присутствующих в продуктах липидов от чрезмерного окисления, так и для защиты самих бактерий от окислительного стресса. Антиоксидантные ферменты, содержащиеся внутри бактериальной клетки, могут ингибировать перекисное окисление липидов в мясопродуктах. Предположительно возможны следующие механизмы ингибирования:

· проникновение в клетки бактерий активных форм и соединений кислорода (например, НО^•₂ и Н₂О₂), образующихся ферментативным или неферментативным путем в мясопродуктах, и их деактивация внутри клетки (каталаза, СОД);

антиоксидантное действие ферментов, выходящих из клеток бактерий при их разрушении в процессе производства продуктов.

Дата добавления: 2014-01-06