Прямая и опосредованная амперометрия. Электроды 1-го, 2-го и 3-го поколений

(1) Прямая амперометрия (ПРЯМОЙ ПЕРЕНОС ЗАРЯДОВ НА ЭЛЕКТРОД). Электроды первого поколения.

Рассмотренные кислородный и перекисный электроды относятся к преобразователям, положившим основу биосенсорам (биоэлектродам) первого поколения. Амперометрические ферментные электроды этого типа объединяют способность фермента к специфическому распознаванию молекул-"мишеней" и возможность прямого электрохимического преобразования биохимической реакции в электрический ток. В основу функционирования ферментных электродов первого поколения положена природная ферментативная реакция окисления субстратов. В этом случае электрод используют для определения концентрации либо исходного субстрата О2, при этом сигнал зависит от концентрации кислорода в окружающей среде, либо продукта реакции Н2О2.

(2) Электроды второго поколения - медиаторные биосенсоры (ОПОСРЕДОВАННЫЙ МЕДИАТОРАМИ ПЕРЕНОС ЗАРЯДОВ НА ЭЛЕКТРОД). Применение принципа эстафетного переноса электронов от субстрата на электрод используется в электродах медиаторного типа. Суть протекающих в них реакций следующая. В дополнение к ферменту в состав рецепторного элемента вводят медиатор. Его могут иммобилизовать наряду с ферментом, возможно применение водорастворимого медиатора, раствор которого для проведения анализа добавляется в ячейку. Фермент вступает в окислительно-восстановительную (редокс) реакцию с субстратом и после восстановления субстратом окисляется медиатором, а не кислородом. Медиатор, в свою очередь, окисляется на электроде. Протекающие реакции можно представить следующим образом:

Глюкоза + ГОД/ФАД -> глюконолактон + ГОД/ФАДH2

ГОД/ФАДH2 + 2M -> ГОД/ФАД +2M' + 2H+

На электроде: 2M' -> 2М + 2e-

В этой схеме ФАД представляет собой флавиновый редокс-центр глюкозооксидазы, М - медиатор, окисленная форма, М' – восстановленная форма. Рядом исследований показано, что эффективными медиаторами могут служить пары ферроцен/ферроцений, а также такие вещества, как диметилферроцен, дихлорфенолиндофенол, феррицианид, K3[Fe(CN)6]3-, катион N- метилфеназиния (NMP+) и ряд других. Возникающий в результате поток электронов от субстрата к электроду обеспечивает генерацию аналитического сигнала; медиатор играет роль эстафетного переносчика электронов и в процессе биохимической реакции не расходуется. Для измерений с помощью медиаторного биосенсора необходимо приложить определенный потенциал к измерительному электроду, в противном случае эстафетный перенос электронов не будет происходить. Каждому медиатору соответствует свой рабочий потенциал.

Положительным качеством медиаторных электродов является возможность таким образом выбрать медиатор для данного типа анализа, что влияние других соединений, которые могли бы окисляться на электроде, будет значительно снижено. Такой подход позволяет повысить селективность биосенсорной детекции. Использование медиатора предоставляет ряд явных преимуществ. При условии, что медиатор в восстановленной форме не реагирует с кислородом, результаты измерений становятся фактически независимыми от парциального давления, т.е. от содержания О2 в среде. Во-вторых, рабочий потенциал ферментного электрода определяется формальным окислительно-восстановительным потенциалом (Ео) медиаторной пары, что особенно удобно, если значение Ео мало, поскольку при этом снижается вероятность протекания побочных реакций. Наконец, если в процессе окисления восстановленного медиатора не участвуют протоны, то ферментный электрод может быть относительно нечувствительным к изменениям рН (при этом очевидно, что сенсором нельзя выполнять измерения при очень низких или высоких значениях рН, при которых происходит денатурация фермента).

Для использования на практике медиатор должен удовлетворять следующим критериям:

- быстро реагировать с восстановленным ферментом;

- реакции с его участием должны быть обратимы;

- медиатор должен быть устойчив как в окисленной, так и в восстановленной форме;

- восстановленный медиатор не должен реагировать с О2;

- для многих случаев использования требуется, чтобы медиатор был нетоксичным.

Практичнее всего применять закрепленный на поверхности электрода медиатор так, чтобы он находился в электрохимически активной форме и мог реагировать с восстановленным ферментом. На сегодняшний день одним из лучших классов медиаторных соединений являются ферроцен и его производные. Для конструирования датчиков можно использовать углеродные пасты, в которые введен нерастворимый медиатор. Для этого пасту, состоящую из графита, жидкого парафина и медиатора, тщательно перемешивают и помещают в специальное углубление в торце электрода. Сам электрод выполняют в виде платинового диска, закрепленного в углублении. Фермент можно вводить в состав пасты, кроме того, его можно также удерживать на поверхности пастового электрода диализной мембраной.

(3) Электроды третьего поколения - прямой перенос электронов. В процессе развития биосенсорных исследований для повышения чувствительности и селективности анализа было предложено оригинальное решение – использовать безмедиаторный способ регистрации тока при окислении субстрата путем непосредственного окисления восстановленного фермента на электроде. В общем случае эта задача экспериментально пока не реализуется. Для прямого переноса электронов требуется выполнение многих условий и современные знания электрохимических свойств и структуры белков не всегда позволяют получить требуемые режимы. Этот процесс определяется рядом параметров, в первую очередь такими, как особенность конфигурации молекулы фермента в области активного центра, величиной приложенного потенциала, типом материала, из которого изготовлен электрод, типом молекулы, с помощью которой фермент иммобилизовали на электроде. В случае прямого переноса заряда реакция схематически представляется следующим образом.

Глюкоза + ГОД/ФАД -> глюконолактон + ГОД/ФАДH2

На электроде: ГОД/ФАДH2 -> ГОД/ФАД + 2H+ + 2e-

Дата добавления: 2014-01-07