Работа 6. Исследование денатурации белков

Приготовление буферных систем для определения ИЭТ казеина

Работа 5. Определение изоэлектрической точки белка

Белок как амфотерный полиэлектролит содержит положительные и отрицательные заряды, соотношение которых определяется количеством кислых и основных аминокислот в его макромолекуле. Заряженность молекулы белка является одним из факторов его устойчивости в растворах, так как мешает слипанию белковых частиц и выпадению их в осадок. На общий заряд макромолекулы белка влияет рН среды. Для каждого белка существует значение рН, при котором сумма положительных и отрицательных зарядов его равна нулю. Это состояние белка называется изоэлектрическим, а соответствующее такому состоянию значение рН называется изоэлектрической точкой (ИЭТ). В ИЭТ растворы белков неустойчивы и белки легко выпадают в осадок особенно в присутствии водоотнимающих веществ (этиловый спирт, ацетон и т.д.).

Реактивы. Уксусная кислота, 0,2 М раствор; ацетат натрия, 0,2 М раствор; этиловый спирт, 96%-ный.

Оборудование. Пипетки вместимостью 1 и 2 мл; штатив с пробирками.

Материал. Казеин, 0,1%-ный раствор.

Метод основан на способности растворенного белка (казеина) в изоэлектрической точке переходить в неустойчивое состояние и выпадать в осадок, что проявляется в выраженном помутнении раствора. При добавлении этилового спирта (водоотнимающее средство) процесс осаждения белка ускоряется.

Ход определения. В шести пронумерованных пробирках готовят буферные смеси с разным значением рН. Содержимое пробирок взбалтывают и в каждую добавляют по 0,5 мл раствора казеина.

№ пробирки	Состав буферной смеси, мл	рН смеси
0,2 М CH3COOH	0,2 М CH3COONa
	1,9	0,1	3,4
	1,8	0,2	3,8
	1,4	0,6	4,4
	1,0	1,0	4,7
	0,6	1,4	5,1
	0,2	1,8	5,7

После этого смесь в пробирках снова встряхивают и отмечают помутнение раствора. В каждую пробирку добавляют по 2 мл этилового спирта и оценивают степень мутности проб.

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы, отмечая степень мутности раствора до и после добавления этилового спирта по пятибальной шкале: 1 – отсутствие помутнения, 2 – слабое, 3 – умеренное, 4 – сильное, 5 – очень сильное.

рН	Степень мутности раствора казеина
до добавления спирта	после добавления спирта
3,4
3,8
4,4
4,7
5,1
5,7

В выводе отметить ИЭТ казеина и возможность ее практического использования для выделения этого белка.

Практическое значение работы. Нахождение изоэлектрической точки для индивидуальных белков позволяет подобрать условия для осаждения их из биологических экстрактов, содержащих смесь разных белков, и при очистке белковых препаратов в фармации.

Вещества, нарушающие структурную организацию белковой молекулы (т.е. четвертичную, третичную и даже вторичную структуры), приводят к изменению физико-химических и биологических свойств белка. Это явление называется денатурацией.

Денатурирующие факторы делятся на химические, физические и биологические. Наиболее обширны группы химических факторов (кислоты, тяжелые металлы, алкалоиды, поверхностно-активные вещества и т.д.) и физических факторов (температура, ионизирующая радиация, ультразвук и т.д.). Биологическую денатурацию могут вызвать протеолитические ферменты (например, трипсин), которые разрушают высшие уровни организации молекулы белка перед тем, как гидролизовать ее пептидные связи.

Денатурация изменяет физико-химические свойства белка, в частности, его растворимость. При этом белок становится менее гидрофильным и легко осаждается. Денатурация чаще всего необратима, но в ряде случаев удаление денатурирующих агентов приводит к восстановлению исходной конформации молекулы белка и его природных свойств – ренатурация.

Реактивы. Азотная кислота, конц.; сульфат меди, 5%-ный раствор; сульфат свинца, 5%-ный раствор; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; хлорная кислота, 10%-ный раствор; этиловый спирт, 96%-ный; ацетон.

Оборудование. Штатив с простыми пробирками; пипетки; водяная баня.

Материал. Раствор яичного белка (приготовление см. работу 1).

а. Денатурация белка концентрированными минеральными кислотами. Метод основан на способности минеральных кислот вызывать нейтрализацию зарядов и разрушение пространственной структуры белка, что приводит к его денатурации и осаждению.

Ход определения. В пробирку наливают 10 капель концентрированной азотной кислоты и осторожно, держа пробирку под углом 45˚, наслаивают на кислоту 5 капель раствора яичного белка. Отметить изменения на границе двух слоев жидкостей (кольцо денатурированного белка).

б. Денатурация белка органическими кислотами. Метод основан на способности органических кислот нейтрализовать заряд молекулы белка и разрушать ее пространственную структуру, что приводит к денатурации и осаждению белка.

Ход определения. В две пробирки наливают по 10 капель раствора яичного белка. Добавляют в одну из них 2 капли трихлоруксусной кислоты, а в другую – 2 капли хлорной кислоты, отмечают произошедшие изменения.

в. Денатурация белка солями тяжелых металлов. Метод основан на связывании ионов тяжелых металлов с функциональными группами боковых радикалов аминокислот в молекулу белка, в результате чего разрушается ее пространственная структура и происходит осаждение денатурированного белка. При добавлении избытка солей тяжелых металлов (кроме AgNO₃ и HgCl₂) происходит растворение первоначально образующегося осадка из-за адсорбции иона металла и приобретении вследствие этого белковой молекулой положительного заряда.

Ход определения. В две пробирки вносят по 10 капель раствора яичного белка. В первую из них добавляют 1-2 капли раствора сульфата меди, а во вторую – 1-2 капли раствора ацетат свинца. Наблюдают за выпадением осадка белка. Прибавляют в каждую из пробирок по несколько капель соответствующего осадителя и наблюдают за растворением осадка.

г. Денатурация белка органическими растворителями. Метод основан на способности органических растворителей (спирт, хлороформ) нарушать гидрофобные взаимодействия внутри белковой молекулы и вызывать ее денатурацию, что приводит к снижению растворимости и выпадению денатурированного белка.

Ход определения. В три пробирки наливают по 10 капель раствора белка и добавляют равные объемы органических растворителей: в первую – этиловый спирт, во вторую – ацетон, в третью – хлороформ. Наблюдают за выпадением белка.

Оформление работы. Особенности действия денатурирующих веществ указать в протоколах по каждой реакции осаждения. В выводах отметить причину денатурации белка.

Практическое значение работы. Явление денатурации белков используется в клинике, фармации и биохимических исследованиях:

а) для осаждения белка в изучаемом биологическом материале с целью дальнейшего определения в нем низкомолекулярных субстратов;

б) для выявления присутствия белка в различных биологических экстрактах и жидкостях и количественного его анализа (в частности, качественное и количественное определение белка в моче основано на реакции денатурации белка азотной кислотой);

в) для связывания солей тяжелых металлов белком при лечении отравлений или их профилактике на производстве;

г) для обеззараживания отходов в санитарно практике;

д) для дезинфекции кожи и слизистых покровов.

Работа 7. Исследование высаливания белков

(на примере белков сыворотки крови)

Высаливание – процесс осаждения белков солями щелочных и щелочно-земельных металлов, который является обратимым и сохраняет нативные свойства белков. Высаливание можно проводить не только солями щелочных и щелочно-земельных металлов (Na₂SO₄, NaCl, KCl, MgSO₄, MgCl₂ и др.), но и нейтральными солями, например (NH₄)₂SO₄. Все вещества этого типа нейтрализуют заряд белковых частиц и вызывают их дегидратацию, что ведет к осаждению белка. При растворении осажденного белка в воде происходит восстановление его исходных физико-химических и биологических свойств.

Белки отличаются друг от друга зарядом и гидрофильностью, поэтому можно разделить белки, используя для их осаждения разные концентрации солей или органических растворителей в среде.

Реактивы. Сульфат аммония, насыщенный раствор; сульфат аммония, кристаллический, тонко измельченный; биуретовый реактив^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки; воронки для фильтрования; бумажные фильтры.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на способности сульфата аммония нейтрализовывать заряд молекул белков и вызывать их дегидратацию, что приводит к осаждению белка (высаливанию); при полунасыщении осаждаются глобулины, а при полном насыщении – альбумины сыворотки крови. Это связано с тем, что глобулины менее гидрофильны и имеют большую молекулярную массу, чем альбумины.

Ход определения. В пробирку вносят 20 капель сыворотки крови и добавляют равный объем насыщенного раствора сульфата аммония (получается полунасыщенный раствор). Выпадает осадок глобулинов. Через 5 мин осадок отфильтровывают.

К фильтрату прибавляют тонко измельченный порошок сульфата аммония до тех пор, пока он не перестает растворяться (полное насыщение). Выпадает осадок альбуминов. Осадок отфильтровывают. Фильтрат проверяют на отсутствие белка, проделывая биуретовую реакцию (см. работу 1).

Оформление работы. Результаты оформить в виде таблицы:

Высаливающее вещество

Степень насыщения раствора сульфатом аммония

Осаждаемая фракция белков сыворотки крови

В выводе указать на возможность разделения белков методом высаливания, принцип его и отличия от осаждения путем денатурации.

Практическое значение работы. Метод высаливания используют в клинических лабораториях для разделения альбуминов и глобулинов и определения их соотношения в сыворотке крови. Осажденную фракцию белка можно отделить центрифугированием, растворить и количественно определить содержание ее с помощью различных методов. В норме соотношение альбумин/глобулин в сыворотке крови человека колеблется в пределах 1,5-2,3 и может меняться при патологии, например, при воспалительных заболеваниях, когда увеличивается содержание глобулинов.

Высаливание применяют также для очистки и получения кристаллических препаратов белков.

Дата добавления: 2014-11-06