Работа 8. Количественное определение белка в сыворотке крови

Количественный анализ белков

Для количественного определения белков в биологическом материале или лекарственных препаратах чаще всего употребляются азотометрия, фотоколориметрия, фотонефелометрия и спектрофотометрия.

Азотометрия основана на определении содержания азота белка после минерализации исследуемого образца. Поскольку белки содержат в среднем 16% азота, то найденное количество его умножают на 6,25 (так как 100:16=6,25) и получают содержание белка в пробе. Эти методы (к ним относится классический метод Кьельдаля и его модификации) очень трудоемки и не всегда надежны, так как процентное содержание азота в разных белках колеблется от 14 до 19.

Фотоколориметрическиеметоды основаны на так называемых «цветных» реакциях на функциональные группы белков. Среди них наибольшее применение нашли биуретовая реакция на пептидные группы и реакция Фолина на ароматические радикалы аминокислот (тирозин, триптофан). Биуретовый метод более специфичен, так как пептидные связи имеются только в белках и пептидах. Он широко применяется в клинико-биохимических исследованиях. Метод Лоури, основанный на реакции Фолина, высокочувствительный, но малоспецифичный, поскольку сходную окраску дают свободные ароматические аминокислоты и многие другие соединения, содержащие фенольную группу.

Фотонефелометрические методы определения содержания белка основываются на оценке степени мутности его взвеси в растворах. Эти методы не получили широкого распространения.

Спектрофотометрические методы делятся на прямые и косвенные. Последние представляют собой боле чувствительный и точный вариант фотоколориметрического. После проведения цветной реакции на белки проводят спектрофотометрию окрашенного раствора и по светопоглощению его в монохроматическом свете рассчитывают содержание белка.

Прямой метод состоит в измерении светопоглощения раствора белка в ультрафиолетовой области при 200-220 нм (в этой области абсорбируют пептидные группы белка) и при 280 нм (зона поглощения ароматических радикалов аминокислот, в основном триптофана и тирозина). Эти методы весьма удобны и не требуют предварительного образования окрашенных комплексов. Более специфична спектрофотометрия при 200-220 нм, чем при 280 нм, так как в последнем случае мешает светопоглощение различных низкомолекулярных ароматических соединений, содержащихся в биологическом материале.

Реактивы. Биуретовый реактив^*; хлорид натрия, 0,9%-ный раствор.

Оборудование. Микропипетки и пипетки вместимостью 1 и 5 мл; штатив с пробирками; стеклянные палочки; фотоэлектроколориметр (ФЭК); спектрофотометр (СФ).

Материалы. Сыворотка крови; альбумин, 10%-ный раствор.

а. Биуретовый метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на способности пептидных связей белков и полипептидов образовывать с ионами Cu²⁺ в щелочной среде комплексное соединение фиолетового цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию белка в среде.

Ход определения. Для определения содержания белка в сыворотке крови или в других объектах, содержащих белок, необходимо построить калибровочный график. Для этого применяют стандартный белок – кристаллический альбумин сыворотки крови.

Схема разведения альбумина для построения калибровочного графика приведена в таблице:

№ пробирки	Стандартный 10%-ный раствор альбумина, мл	0,9%-ный раствор хлорида натрия, мл	Концентрация белка, г/л	Экстинкция
	0,4	0,6
	0,6	0,4
	0,8	0,2
	1,0	-

Из каждой пробирки с разведенным стандартным раствором альбумина берут по 0,1 мл раствора и добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию каждой пробы на ФЭКе против контрольного раствора (0,1 мл 0,9%-ного раствора NaCl + 5,0 мл биуретового реактива) в кювете толщиной 1 см, длина волны 540-560 нм (светофильтр зеленый).

По полученным данным строят калибровочную кривую, откладывая по оси ординат значения экстинкции, по оси абсцисс – концентрацию белка.

Берут 2 пробирки – в одну наливают 0,1 мл исследуемой сыворотки, в другую (контрольную) – 0,1 мл раствора хлорида натрия. В обе пробирки добавляют по 5 мл биуретового реактива. Содержимое смешивают встряхиванием.

Через 30 мин измеряют экстинкцию исследуемого раствора на ФЭКе в кювете толщиной 1 см при длине волны 540-560 нм (зеленый светофильтр) против контрольного раствора.

Содержание белка в сыворотке крови находят по калибровочной кривой.

б. Спектрофотометрический метод определения содержания белка в сыворотке крови. Метод основан на светопоглощении при 280 нм ароматических радикалов тирозина, триптофана и в меньшей степени фенилаланина, содержащихся в белке. Однако при данной длине волны поглощают и нуклеиновые кислоты, хотя их максимум абсорбции приходится на 260 нм. Поэтому измерение экстинкции раствора проводят при 260 и 280 нм, чтобы сделать поправку на примесь нуклеиновых кислот и нуклеотидов. Метод неприменим к материалу, где содержание нуклеиновой кислоты превышает 20%.

Ход определения. В пробирку вносят 0,1 мл сыворотки крови и добавляют 9,9 мл раствора хлорида натрия. Содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Измеряют экстинкцию исследуемого раствора против контрольного раствора хлорида натрия на спектрофотометре в кювете толщиной 1 см при двух длинах волн – 260 и 280 нм.

Расчет можно проводить по формуле, эмпирически полученной Калькаром (поэтому можно не прибегать к калибровочному графику):

х = 1,45Е₂₈₀ – 0,74Е₂₆₀,

где х – концентрация белка в растворе, г/л.

Оформление работы. По калибровочной кривой рассчитать содержание белка. Сравнить результаты, полученные биуретовым методом и спектрофотометрическим. Сделать вывод о наличии отклонения концентрации белка в исследуемой сыворотке крови от нормы и о возможных его причинах.

Практическое значение работы. Сыворотка крови содержит смесь белков, различных по физиологическому значению, структуре и физико-химическим свойствам (более 100 различных белков плазмы крови). Нормальное содержание белка в сыворотке крови (нормопротеинемия) составляет 65-85 г/л. Определение общего белка в сыворотке крови находит широкое применение в практической медицине, так как по изменению его нормального содержания можно судить о различных нарушениях в организме. Повышенное содержание белка (гиперпротеинемия) относительно редко: при сгущении крови из-за потери жидкости (длительная рвота, усиленное потоотделение, холера, тяжелые ожоги и т.п.), при некоторых хронических воспалительных процессах вследствие образования антител (ревматизм, полиартрит). Пониженное содержание белка в крови (гипопротеинемия): при недостаточном поступлении белка с пищей (голодание, нарушение проходимости кишечного тракта), при нарушении образования белка в органах (при поражении печени химическими веществами, опухолями, микроорганизмами и т.д.), при потере белка организмом (кровотечения, повышенная проницаемость сосудов, заболевания почек, беременность и т.д.).

В фармацевтической практике количественные методы определения белка необходимы для контроля белковых лекарственных средств (вакцин, сывороток, γ-глобулина, белковых препаратов крови и т.д.).

Дата добавления: 2014-11-06