В сыворотке крови. Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы

Работа 23. Определение глюкозофосфат-изомеразы

( D-глюкозо-6-фосфат кетол-изомераза; КФ 5.3.1.9 )

Реактивы. Субстратная смесь для выявления глюкозофосфат-изомеразы^*, трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; резорцин, 0,1%-ный раствор в 3,6%-ной соляной кислоте; соляная кислота, 36%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 и 5 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении фруктозо-6-фосфата, образующегося в ходе изомеризации глюкозо-6-фосфата под действием глюкозофосфат-изомеразы:

Фруктозо-6-фосфат образует с резорцином в присутствии соляной кислоты соединение красного цвета.

Ход определения. В две пробирки вносят по 0,5 мл сыворотки крови. В одну из них (опытную) добавляют 1 мл субстратной смеси и перемешивают. Помещают обе пробирки на 30 мин в водяную баню при 37˚С, а по окончании инкубации в них приливают по 1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты (для остановки реакции). В контрольную пробу доливают 1 мл субстратной смеси.

После перемешивания содержимое каждой пробирки фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Отбирают по 1 мл фильтрата в чистые пробирки, приливают по 1 мл резорцина и по 3 мл раствора соляной кислоты. Смеси энергично встряхивают и оставляют для развития окраски. Отмечают разницу окрашивания в пробах.

Оформление работы. Отметить различие окраски проб и сделать вывод о присутствии фермента в сыворотке крови.

Дата добавления: 2014-11-06