Препарата лактатдегидрогеназы по Корнбергу

Работа 30. Количественное исследование активности

Реактивы. Фосфатный буфер, 0,1 М с рН 7,4^*; пируват натрия, раствор 2∙10^-2 М на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,4; НАД∙Н динатриевая соль, свежеприготовленный 6∙10^-3 М раствор в дистиллированной воде.

Оборудование. Пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; стеклянная палочка; секундомер; СФ или ФЭК типа КФК-2.

Материал. Разведенный продажный препарат фермента 0,2 мкг/мл. Кристаллический препарат в виде суспензии в 2,2 М растворе сульфата аммония, имеющий активность около 200 ФЕ/мг белка, разводят в 1000 раз 0,1 М фосфатным буфером с рН 7,4 перед опытом (1 ФЕ соответствует 1 мкмоль превращенного субстрата за 1 мин)[2].

Метод основан на непрерывном измерении скорости окисления НАД∙Н₂, используемого на восстановление пирувата в реакции, катализируемой ЛДГ. По уменьшению экстинкции НАД∙Н₂ при 340 нм рассчитывают количество превращенного субстрата за единицу времени. Лактатдегидрогеназа (ЛДГ) катализирует обратимое превращение пирувата в лактат:

Н

ЛДГ

│

СН₃―С―СООН + НАД·Н₂ НАД⁺ + СН₃―С―СООН

║ │

О ОН

пируват лактат

Равновесие реакции сдвинуто вправо, поэтому при изучении ЛДГ удобнее использовать в качестве субстрата пируват и НАД∙Н₂ и по скорости окисления последнего рассчитать активность этого фермента.

Ход определения. В кювету спектрофотометра последовательно вносят 2,4 мл фосфатного буфера, 0,2 мл раствора НАД∙Н₂ и 0,1 мл образца фермента. Перемешивают стеклянной палочкой и ставят в кюветодержатель.

Устанавливают шкалу отсчета экстинкции на 0,400 и ручкой «щель» выводят стрелку гальванометра (при открытой шторке) на нуль. В течение 1 мин проверяют отсутствие неферментативного окисления НАД∙Н₂ (в этом случае экстинкция не падает).

Добавляет в кювету 0,3 мл раствора пирувата натрия (запускают реакцию), быстро перемешивают, ручкой «щель» при открытой шторке возвращают стрелку гальванометра к нулевой отметке и включают секундомер.

Снимают показания экстинкции (падение ее, начиная от отметки 0,400) через каждые 30 с в течение 2-3 мин. Если условия реакции подобраны верно, то за каждые 30 с наблюдается примерно одинаковое уменьшение экстинкции.

Расчет. Удельную активность ЛДГ х (мкмоль∙мин^-1∙мг^-1) рассчитывают по формуле

∆Е_мин3,0∙1000

х = ———————,

6,22∙0,02

где ∆Е_мин – изменение экстинкции в ходе реакции за 1 мин;

6,22 – коэффициент экстинкции 1 мкмоль НАД∙Н₂ в 1 мл среды;

3,0 – объем инкубационной смеси, мл;

0,02 – количество белка в кювете, мкг;

1000 – коэффициент пересчета количества белка в миллиграммы.

Оформление работы. Рассчитать удельную активность ферментного препарата, молекулярную активность ЛДГ (учитывая, что ее молекулярная масса 135000). Сделать вывод о качестве исследуемого препарата (сохранность исходной активности, %).

Практическое значение работы. Принципы измерения активности лактатдегидрогеназы спектрофотометрическим методом непрерывного наблюдения используются при исследовании других ферментных препаратов, очищенных ферментов и в клинико-биохимических лабораториях при количественном определении активности ферментов в биологических жидкостях и биоптатах в норме и при патологии.

Работа 31. Фотоколориметрический метод исследования активности лактатдегидрогеназы в сыворотке крови по Севелу и Товареку

Реактивы. Лактат натрия, 0,45 М раствор или нейтрализованная гидроксидом натрия молочная кислота той же концентрации; пирофосфат натрия, 0,03 М раствор (Na₄P₂O₇∙10H₂O растворить в 50 мл воды, довести рН до 8,8 с помощью 1 М соляной кислоты и долить водой до 500 мл); НАД, свежеприготовленный раствор 3мг/мл; 2,4-динитрофенилгидразин, 0,2%-ный раствор в 1 М растворе соляной кислоты; гидроксид натрия, 0,4 М раствор; пируват натрия, раствор для построения калибровочного графика (содержит 11 мкг пирувата натрия или 8,8 мкг пировиноградной кислоты в 1 мл).

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 0,1; 1 и 5 мл; ФЭК; водяная баня с лабораторным термометром.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении скорости образования пирувата в ходе окисления лактата с участием лактатдегидрогеназы сыворотки крови:

ЛДГ

СН₃―СН―СООН + НАД⁺ СН₃―С―СООН + НАД·Н₂

│ ║

ОН О

лактат пируват

Пируват с 2,4-динитрофенилгидразином образует соответствующий гидразон, имеющий красно-бурое окрашивание в щелочной среде, интенсивность которого прямо пропорциональна содержанию кетокислоты:

Ход определения. Сыворотку крови разводят в 3 раза дистиллированной водой. Вносят в пробирку 0,1 мл разведенной сыворотки, 0,3 мл раствора НАД⁺ и ставят на 5 мин в водяную баню при 37˚С (для прогревания смеси).

Во вторую пробирку добавляют 0,8 мл раствора пирофосфата натрия и 0,2 мл раствора лактата натрия и нагревают на водяной бане при 37˚С.

Выливают содержимое второй пробирки в первую, быстро перемешивают стеклянной палочкой, не вынимая пробирки из бани, и отмечают время начала инкубации. Через 25 мин реакцию останавливают, прибавляя 0,5 мл раствора 2,4-ДНФГ, и оставляют пробирку на 20 мин при комнатной температуре (для образования гидразона).

К смеси приливают 5 мл раствора гидроксида натрия, содержимое перемешивают стеклянной палочкой и через 10 мин (после развития окраски) измеряют экстинкцию опытной пробы против контрольной на ФЭКе при длине волны 520-560 нм (светофильтр зеленый) в кювете с толщиной слоя 1 см.

Контрольную пробу готовят как опытную, но разведенную сыворотку добавляют после инкубации.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробы	Пируват натрия, мл	Пирофосфат натрия, мл	Дистиллированная вода, мл	Содержание пирувата в пробе, мкмоль	Единицы активности ЛДГ, ммоль/ч∙л	Экстинкция
	0,1	0,8	0,5	0,01	1,2
	0,2	0,8	0,4	0,02	2,4
	0,4	0,8	0,2	0,04	4,8
	0,6	0,8	-	0,06	7,2
	0,8	0,6	-	0,08	9,6

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие им единицы активности ЛДГ, выраженные в ммоль/(ч∙л).

Оформление работы. Рассчитать активность фермента в исследуемой сыворотке крови, сделать вывод о возможном изменении активности и его причинах.

Практическое значение работы. Определение активности лактатдегидрогеназы используется в клинико-биохимических лабораториях для диагностики и установления прогноза заболевания. В норме активность фермента составляет 0,8-4,0 ммоль/(ч∙л) и возрастает, как правило, у больных с повреждением миокарда, скелетных мышц, почек, а также при анемиях, опухолевых поражениях, остром гепатите и т.д.

Работа 32. Определение активности щелочной фосфатазы

в сыворотке крови по Боданскому

Фосфатазы – ферменты, отщепляющие фосфат от различных субстратов. Среди них имеются энзимы с неодинаковой специфичностью по отношению к субстратам. Щелочная фосфатаза действует в щелочной среде (чем отличается от фосфатаз, осуществляющих катализ в нейтральной или кислой средах) и является малоспецифичной.

Реактивы. β-Глицерофосфат, щелочной раствор на мединаловом буфере с рН 8,6^*; трихлоруксусная кислота, 10%-ный раствор; реактив молибдата аммония^*; аскорбиновая кислота, 1%-ный раствор на 0,1 М растворе соляной кислоты; дигидрофосфат калия (навеску 0,4394 г KH₂PO₄, предварительно высушенного в эксикаторе над серной кислотой, взвешивают на аналитических весах и растворяют в колбе вместимостью 100 мл; затем этот раствор разводят в 100 раз и используют для построения калибровочной кривой).

Оборудование. Штатив с пробирками; центрифуга лабораторная с центрифужными весами; пипетки вместимостью 0,2; 1 и 5 мл; водяная баня с лабораторным термометром; ФЭК.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на фотоколориметрическом определении неорганического фосфора, отщепляемого от β-глицерофосфата под действием фосфатазы сыворотки крови в щелочной среде:

СН₂ОН СН₂ОН

│ Фосфатаза │

НС―О―РО₃Н₂ + Н₂О НС―ОН + Н₃РО₄

│ рН 8,6 │

СН₂ОН СН₂ОН

β-глицерофосфат глицерин

Неорганический фосфат определяют по образованию фосфомолибдата аммония с последующим восстановлением его в молибденовую синь аскорбиновой кислотой (см. работу 11).

Ход определения. В две пробирки вносят по 1 мл раствора β-глицеро­фосфата и помещают на 5 мин в водяную баню при 37˚С. Затем в опытную пробирку добавляют 0,2 мл сыворотки крови, перемешивают и отмечают время начала инкубации в водяной бане.

Через 1 час приливают в обе пробирки по 1,8 мл раствора трихлоруксусной кислоты, а в контрольную – еще 0,2 мл сыворотки крови. Перемешивают пробы, оставляют стоять 5 мин для осаждения белка. Центрифугируют содержимое обеих проб в течение 5 мин при 3000 об/мин.

Отбирают в чистые пробирки по 1,5 мл надосадочной жидкости (для определения в ней неорганического фосфата Ф_н) и приливают по 1 мл реактива молибдата аммония и по 1 мл раствора аскорбиновой кислоты. Через 10 мин измеряют экстинкцию опытной и контрольной проб на ФЭКе, при длине волны 630-690 нм (красный светофильтр) в кювете с толщиной слоя 0,5 см против раствора реактивов (1,5 мл раствора трихлоруксусной кислоты и 1,5 мл дистиллированной воды).

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику, условия построения которого приведены в таблице.

№ пробы	Раствор KH2PO4, мл	Н2О, мл	Трихлор­уксусн. кислота, мл	Молибдат аммония, мл	Аскорбиновая кислота, мл	Фн в пробе, мг	Активность фермента, ммоль/(ч∙л)
	0,1	0,9	0,5	1,0	1,0	0,001	0,32
	0,2	0,8	0,5	1,0	1,0	0,002	0,64
	0,4	0,6	0,5	1,0	1,0	0,004	1,29
	0,6	0,4	0,5	1,0	1,0	0,006	1,93
	1,0	-	0,5	1,0	1,0	0,010	3,22

По оси ординат откладывают значения экстинкции, а по оси абсцисс – соответствующие единицы щелочной фосфатазы, выраженные в ммоль/(ч∙л).

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности щелочной фосфатазы в сыворотке крови в основном у больных с поражениями костной ткани и печени, особенно с явлениями задержки оттока желчи. В норме активность фермента составляет 0,5-1,3 ммоль/(ч∙л). Повышение активности в сыворотке крови наблюдается при рахите (гиповитаминозе D), опухолях костной ткани, гиперпаратиреозе, механической желтухе, вирусном гепатите и т.д., а снижение – при гипотиреозе, гиповитаминозе С и др.

Дата добавления: 2014-11-06