В сыворотке крови. Реактивы. L-γ-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил-глицин*; субстратно-буферный раствор*; уксусная кислота ледяная

Реактивы. L-γ-глутамил-п-нитроанилид; натрия хлорид; глицил-глицин^*; субстратно-буферный раствор^*; уксусная кислота ледяная, раствор 100 г/л; основной калибровочный раствор п-нитроанилида^*.

Оборудование. Пипетки на 0,1; 1,0 и 5,0 мл; термостатирующая водяная баня; спектрофотометр или фотоэлектроколориметр.

Материал. Сыворотка крови.

Метод основан на определении п-нитроанилида, образующегося из L-γ-глутамил-п-нитроанилида при ферментативном переносе L-γ-глутамилового остатка на глицил-глицин.

ГТФ

γ-глутамил-п-нитроанилид + глицил-глицин

γ-глутамил-глицилглицид + п-нитроанилин

Ход определения. В опытную пробирку вносят 0,5 мл раствора субстрата и помещают в водяную баню при температуре 37°С. Через 5 минут приливают 0,05 мл сыворотки крови, содержимое перемешивают и инкубируют точно 15 минут при температуре 37°С. Затем прибавляют 3 мл раствора уксусной кислоты и перемешивают. Контрольную пробу ставят также как опытную, но сыворотку добавляют после инкубации. Измеряют на спектрофотометре при длине волны 410 нм или на ФЭКе при длине волны 400-500 нм (фиолетовый или синий светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против контрольной пробы. Окраска стабильна в течение нескольких часов.

Расчет. Активность фермента рассчитывают по калибровочному графику.

Оформление работы. По полученным значениям экстинкции найти активность фермента. На основании этого сделать вывод о возможности изменения активности в исследуемой сыворотке и указать на предполагаемые причины.

Практическое значение работы. В клинике используется определение активности γ-глутамилтрансферазы в сыворотке крови в основном при заболеваниях печени и желчных путей. В норме активность составляет для мужчин 250-1767 нмоль/с·л (15-106 МЕ), для женщин – 167-1100 нмоль/с·л или 10-66 МЕ. Повышение активности фермента наблюдается при заболеваниях желчных путей с явлениями обтурации, при гепатитах, опухолях и метастазах в печень. Следует отметить, что увеличение γ-глутамилтрансферазы, как правило, увеличивается параллельно активности щелочной фосфатазы, но активность γ-глутамилтрансферазы возрастает раньше, остается повышенной более длительное время и относительное увеличение активности фермента в несколько раз выше, чем щелочной фосфатазы. Следует отметить, что наркотики, седативные средства, этанол, стимулируют активность фермента, что используется для диагностики алкогольно-токсических заболеваний печени.

Дата добавления: 2014-11-06