Мышечной ткани

Модификаторы активности ферментов

Вещества, изменяющие активность ферментов (модификаторы), делятся на активаторы и ингибиторы. Они стимулируют или угнетают активность фермента, влияя на его активный или аллостерический центры. Модифицирующее влияние различных соединений на активность фермента устанавливают путем кинетических исследований.

Работа 27. Активаторы и ингибиторы α-амилазы слюны

Реактивы. Крахмал, 0,5%-ный раствор; хлорид натрия, 1%-ный раствор; сульфат меди (II), 1%-ный раствор; фенилтиомочевина. 0,02%-ный раствор; раствор иода в иодиде калия^*.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки; водяная баня с лабораторным термометром; часы.

Материал. Слюна, полученная, как в работе 18, и разведенная водой в 10 раз.

Метод основан на сравнении скорости гидролиза крахмала (продукт гидролиза крахмала обнаруживают пробой с иодом) под действием α-амилазы слюны до и после добавления фенилтиомочевины, ионов Cl‾ и Cu²⁺.

Ход определения. Берут четыре пробирки и наливают по 10 капель: в первую – дистиллированной воды, во вторую – раствора хлорида натрия, в третью – раствора сульфата меди и в четвертую – раствора фенилтиомочевины, а затем по 20 капель раствора крахмала и по 1 капле разведенной слюны. Содержимое перемешивают встряхиванием, помещают пробирки в водяную баню при 38˚С и засекают время начала инкубации.

Через каждые 1-2 мин из проб отбирают в другие пробирки по 1 капле жидкости и добавляют 1 каплю раствора иода в иодиде калия. Отмечают время появления красного окрашивания (стадия образования эритродекстринов) при проведении реакции с иодом в каждой из пробирок.

Оформление работы. Результаты занести в таблицу, сделать вывод о действии изученных веществ и о предполагаемом типе ингибиторов.

Фермент

Модификатор активности

Субстрат

Время образования эритродекстринов, мин (проба с иодом)

Работа 28. Действие конкурентных ингибиторов на сукцинат-дегидрогеназу (сукцинат: акцептор оксидоредуктаза; КФ 1.3.99.1)

Реактивы. Малоновая кислота, 1%-ный раствор, нейтрализованный NaOH; сукцинат натрия, 1%-ный раствор; метиленовый синий, 1%-ный раствор; вазелиновое масло.

Оборудование. Штатив с пробирками; пипетки вместимостью 1 мл; водяная баня; лабораторный термометр.

Материал. Мышечная кашица, полученная после забоя животного.

Метод основан на сравнительном определении активности сукцинатдегидрогеназы по обесцвечиванию в ходе реакции метиленовой сини (МС) как акцептора водорода в присутствии и в отсутствии малоновой кислоты.

Сукцинатдегидрогеназа

COOH COOH

│ │

CH₂ CH

│ ФАД⁺ ФАД∙Н₂ ║

CH₂ HC

│ │

COOH COOH

сукцинат фумарат

МС∙Н₂ МС

(бесцветная форма) (синее окрашивание)

Образующийся ФАД∙Н₂ восстанавливает метиленовую синь (МС∙Н₂), в результате чего происходит обесцвечивание раствора. Сравнивая визуально уменьшение интенсивности синего окрашивания с пробами, содержащими разные количества малоновой кислоты (НООС – СН₂ – СООН), делают вывод о типе действия ее на фермент.

Ход определения. В три пробирки помещают по 3-4 г мышечной кашицы и добавляют в первую пробирку 0,8 мл воды, во вторую 0,2 мл раствора малоновой кислоты и 0,6 мл воды, а в третью – 0,8 мл раствора малоновой кислоты.

Во все пробирки приливают по 1 мл раствора сукцината натрия, по 1 капле раствора метиленового синего и после перемешивания по 3-4 капли вазелинового масла. Пробирки ставят в водяную баню при 37˚С. Через 3-5 мин наблюдают обесцвечивание раствора.

Оформление работы. Сравнить интенсивность голубого окрашивания в трех пробирках и сделать вывод о механизме действия малоновой кислоты на активность сукцинатдегидрогеназы.

Практическое значение работы. Конкурентные ингибиторы различных ферментов широко применяются в биохимических исследованиях и в практической медицине как лекарственные препараты. В частности, малоновая кислота как конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы используется в экспериментах на животных для того, чтобы изучить изменения в обмене веществ в тканях при блокаде этого фермента, а также для исследования самого механизма конкурентного торможения.

Дата добавления: 2014-11-06