Количественное определение активности ферментов

Работа 29. Неконкурентное ингибирование каталазы крови

Реактивы. Пероксид водорода, 3%-ный раствор; азид натрия, 1%-ный раствор.

Оборудование. Штатив с пробирками; глазные пипетки.

Материал. Цельная кровь, разведенная водой в 10 раз.

Метод основан на визуальном сравнении интенсивности выделения пузырьков газа (кислорода) при разложении пероксида водорода с участием каталазы крови в отсутствии и в присутствии азида натрия NaN₃.

Ход определения. В две пробирки вносят по капле крови и добавляют в одну их них 2 капли воды, а в другую – такой же объем раствора азида натрия. Пробы встряхивают.

Через 2 мин прибавляют в обе пробирки по 2 мл раствора пероксида водорода и сравнивают интенсивность выделения пузырьков газа.

Оформление работы. По полученным данным сделать вывод о действии азида натрия на каталазу крови и указать на практическое значение работы.

Практическое значение работы. Неконкурентными ингибиторами геминовых ферментов (цитохромы, цитохромоксидаза, каталаза и пероксидаза) являются азиды и цианиды, которые взаимодействуют с железом гема, входящего в активный центр, подавляя тем самым каталитическую активность этих ферментов. Благодаря этому азиды и цианиды являются сильными ядами. Учитывая, что они неконкурентные ингибиторы, снять их действие можно только теми веществами, которые связывают их и освобождают из активного центра фермента.

В клинико-биохимических лабораториях широко используется количественное определение активности ферментов для диагностики заболеваний, а также для контроля за проводимым лечением. В фармации оно необходимо для контроля качества ферментных препаратов, а в научных биохимических исследованиях – для наблюдения за процедурой очистки фермента.

Об активности фермента судят по количеству превращенного субстрата или образовавшегося продукта реакции за определенный промежуток времени. Скорость ферментативной реакции графически описывается в виде гиперболы – кривая Михаэлиса-Ментен, поэтому для правильного измерения активности ферментов необходимо соблюдать ряд правил. Определение следует вести в стандартных условиях, т.е. при насыщающих концентрациях субстрата или субстратов, оптимуме рН среды и постоянной температуре, которые должны поддерживаться весь период наблюдения. При изучении сложных ферментов в среду добавляют необходимые кофакторы. Эти условия обеспечивают нулевой порядок реакции, при которой ее скорость лимитируется только концентрацией исследуемого фермента. Измерять активность фермента нужно не за любой отрезок времени, а только за начальный, когда скорость реакции протекает линейно, т.е. за единицу времени превращается одно и то же количество субстрата (это так называемая начальная скорость реакции).

В зависимости от способа регистрации все методы определения ферментативной активности можно подразделить на два типа: метод отбора проб и непрерывного наблюдения. В первом случае перед инкубацией и через определенные отрезки времени в ходе реакции отбирают пробы раствора, осаждают белок и определяют в безбелковой жидкости содержание субстратов или продуктов реакции. По полученным данным строят кривую зависимости образования продуктов реакции от времени и рассчитывают активность фермента. Во втором случае наблюдение ведут непрерывно или автоматически регистрируют ход реакции, если субстрат (или продукт реакции) поглощает в определенной области спектра или флуоресцирует, что позволяет постоянно следить за изменением его концентрации в среде за выбранные промежутки времени.

Метод непрерывной регистрации очень чувствителен, удобен и экономичен, так как для него требуются небольшие количества биологического материала или ферментного препарата. Он широко применяется при количественном измерении активности окислительных ферментов, для действия которых необходимы никотинамидные коферменты. Окисленные формы их (НАД⁺ и НАДФ⁺) не поглощают при 340 нм, а восстановленные (НАД∙Н₂ и НАДФ∙Н₂) имеют максимум абсорбции при этой длине волны. Поэтому скорость ферментативной реакции определяют по степени восстановления окисленных форм данных коферментов или по степени окисления восстановленных форм.

Для выражения активности таких ферментов используют молярный коэффициент экстинкции восстановленных форм НАД и НАДФ, который при 340 нм равен 6,22∙10⁶ см²/моль, или 6,22∙10³л∙моль^-1∙см^-1. Это означает, что если в процессе реакции произошло изменение экстинкции на 6,22∙10⁶, то это указывает на образование (или убыль) 1 моля восстановленного кофермента в расчете на 1 мл реакционной смеси. Если экстинкция изменяется на 6,22∙10³ или на 6,22, то соответственно образуется (или расходуется) в ходе реакции 1 ммоль или 1 мкмоль восстановленных коферментов на 1 мл среды. Можно также наблюдать за скоростью ферментативной реакции по поглощению восстановленного НАД и НАДФ при 366 нм. Молярный коэффициент экстинкции в этом случае равен 3,3∙10⁶ см²/моль.

Концентрацию исследуемого фермента подбирают таким образом, чтобы обеспечить изменение экстинкции на 0,010-0,100 за 1 мин. Если этот показатель выше, то проба, содержащая фермент, разводится, если ниже, то берется больший объем изучаемого образца.

Для непрерывного наблюдения за ходом реакции по светопоглощению восстановленных форм НАД (НАДФ) или других субстратов при определенной длине волны требуются спектрофотометры. Однако, современный фотоэлектроколориметр типа КФК-2 позволяет проводить измерения ферментативной активности, например, при 366 нм (расчет производится по экстинкции раствора НАД∙Н или НАДФ∙Н с известной концентрацией).

При невозможности наблюдать за реакцией непрерывно активность фермента измеряют методом отбора проб, причем содержание субстратов и продуктов реакции определяют разными способами. Наиболее распространены колориметрические методы.

Правила выражения активности ферментов в единицах СИ были изложены ранее (см. с.11). Температура, при которой проводится определение, указывается при выражении активности фермента.

Дата добавления: 2014-11-06