Контроль виконання лабораторної роботи. Дослід 2. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину

Дослід 2. Кількісне визначення активності пептидаз панкреатину.

Принцип методу. Метод ґрунтується на здатності пептидаз гідролізувати пептидні зв’язки, що приводить до зростання кількості вільних аміно- та карбоксильних груп. Після блокування аміногруп формаліном, карбоксильні групи підвищують кислотність середовища, приріст якого визначається титруванням лугом за методом Зернсена в присутності індикатора фенолфталеїну.

Матеріальне забезпечення: 6 % розчин казеїну, фосфатний буфер рН 7,6, панкреатин, фенолфталеїн, 0,2 н розчин NaОН, 0,02н розчин NaОН, формольна суміш рН 8,3, штатив з пробірками, піпетки, колбочки для титрування, бюретка, водяна баня, термометр, газовий пальник.

Хід роботи. У дві пробірки відмірюють по 5 мл 6 % розчину казеїну і по 2 мл фосфатного буферу рН 7,6. В одну з пробірок додають 0,5 г панкреатину, старанно перемішують і ставлять у водяну баню при температурі 37⁰С разом з контрольною пробіркою.

Через 30 хв пробірки знімають з бані, охолоджують, їх вміст переливають у колбочки для титрування, додають в кожну по 2-3 краплі фенолфталеїну і підлужнюють з піпетки 0,2 н розчином NaОН до утворення блідорожевого забарвлення (рН-8,3).

При такому рН кількість аміногруп у розчині дорівнює кількості карбоксильних груп. Далі в обидві колбочки додають по 5 мл формольної суміші (рН-8,3). Формалін зв’язує аміногрупи, а карбоксильні групи зсувають рН розчину в кислу сторону. Розчин знебарвлюється. Обидві проби титрують із бюретки 0,02 н розчином NaOH до утворення слабо-рожевого забарвлення (рН 8,3) і додають ще декілька крапель 0,02 н розчину NаОН до яскраво червоного кольору (рН 9,1).

Вираховують різницю між даними титрування досліджуваного і контрольного розчинів. Активність пептидаз виражають в умовних одиницях. Одна умовна одиниця відповідає 1 мл 0,02 н розчину NаОН, затраченого додатково на титрування дослідної проби.

Приклад розрахунку:

Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування гідролізату казеїну............. мл.

Кількість 0,02 н NаОН, що пішла на титрування контрольного розчину...…. мл.

Різниця у кількості 0,02 н NaOH між дослідним і контр. розчином................. мл.

Пояснити отриманий результат. Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У нормі активність пептидаз сироватки крові становить 0,2-1,7мкмоль/мл год. Збільшення вмісту пептидаз у сироватці крові та зростання їх активності спостерігається при гострому панкреатиті, виразковій хворобі, обширних опіках, гострому гепатиті. Зниження активності пептидаз може спостерігатися при емфіземі легень, цирозі печінки.

1. Катал – одиниця активності ферменту, яка виражає:

А. Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 хвилину

В.Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоля субстрату за 1 секунду

С. Число одиниць ферментативної активності, що припадає на 1 мг білка

D. Кількість молекул субстрату, що перетворюється однією молекулою ферменту за хвилину

Е. Кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 моля субстрату за 1 секунду.

2. Яке явище лежить в основі механізму дії ферментів?

А. Утворення фермент-субстратного комплексу

В. Зближення груп, що входять до активного центру ферментів

С. Зміна просторової конфігурації

D. Зниження електричного заряду ферменту

Е. Гідроліз ферменту

3. Пептидази каталізують розщеплення:

А. Ліпідів

Б. Нуклеїнових кислот

В. Полісахаридів

D. Поліпептидів

Е. Олігосахаридів

4. До пептидаз відносять наступні ферменти:

А. Уреазу

В. АТФазу

С. РНК-полімеразу

D. Амілазу

Е. Трипсин

5. У сироватці крові хворого виявлено різке підвищення активності трипсину, б-амілази, ліпази. Про яке захворювання можна говорити?

A. Холестаз

B. Хронічний гепатит

C. Злоякісні новоутворення

D. Гострий панкреатит

E. Отруєння інсектицидами

6. В підшлунковій залозі знаходяться ферменти: амілаза, пептидази та ліпази. Які з цих ферментів за певних умов може викликати автоліз органу і чому?

7. У хворого гострий панкреатит. Які препарати повинен призначити лікар, щоб уникнути автолізу підшлункової залози?

8. Попадання в організм метилового спирту в кількості біля 30мл є дуже токсичним і може призвести до смерті. Отруйний для організму не сам метанол, а його продукт – формальдегід, який утворюється за участі алкогольдегідрогенази. Одним з методів в лікуваннях при цьому є введення надмірної кількості етилового спирту. Поясніть, на чому основана така лікувальна дія.

9. Поясніть основні принципи визначення активності ферментів на прикладі амілази слини (йод-крохмальна реакція та реакція Тромера).

10. Поясніть механізм перетворення субстрату за умов каталітичної дії ферменту.

Приклади тестів “Крок-1”

1. Під час операції у хворого після введення препарату, який викликає розслаблення м’язів спостерігається тривала зупинка дихання (більше 5 хв). Недостатність якого з наведених ферментів спостерігалась?

А. Каталаза

В. Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа

С. Моноамінооксидаза

D. Ацетилтрансфераза

Е. Ацетилхолінестераза

2. Фармпрепарати, що містять ртуть, миш’як та інші важкі метали інгібують ферменти, які мають сульфгідрильні групи. Яку амінокислоту використовують для реактивації цих ферментів?

А. Гістидин

В. Ізолейцин

С. Цистеїн

D. Аспарагінову кислоту

Е. Гліцин

3.Протеолітичні ферменти ШКТ каталізують гідроліз білків. Вкажіть, який хімічний зв’язок вони розщеплюють:

A. Пептидний

B. Глікозидний

C. Водневий

D. Ефірний

E. Фосфодіефірний

4. Амілолітичні ферменти каталізують гідроліз полісахаридів і олігосахаридів. На який хімічний зв’язок вони діють?

A. Глікозидний

B. Складноефірний

C. Пептидний

D. Амідний

E. Фосфодіефірний

5. Ліполітичні ферменти ШКТ каталізують гідроліз ліпідів. Вкажіть хімічний зв’язок, який вони розщеплюють:

A. Складноефірний

B. Пептидний

C. Глікозидний

D. Водневий

E. Амідний

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – С. 86-137.

2. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Вінниця: Нова книга, 2009. – С. 115 – 147.

3. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – С. 66-107.

4. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Київ: Медицина, 2010. – С.47-62.

5. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 51-66.

6. Скляров О.Я., Сольскі Я., Великий М.М. та ін.. Біохімія ензимів. Ензимодіагностика. Ензимопатологія. Ензимотерапія. – Львів: Кварт, 2008. – С.11-26.

Додаткова:

1. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – С. 114 – 168.

3. Клінічна біохімія: Підручник / За ред. О.Я.Склярова. – Київ: Медицина, 2006. – 431 с.

4. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 470 с.

5. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. Т.1. – М.: Мир; Бином. Лаборатория знаний, 2009. – С. 63 – 110.

Дата добавления: 2014-11-25