Дослід 2. Дослідити вплив фосфаколу та іонів кальцію на активність холінестерази

Дослід 1. Дослідити вплив активаторів та інгібіторів на активність амілази слини.

Практична робота

Принцип методу. Сполуками, що підвищують активність ферментів – активаторами – є іони багатьох металів, зокрема: Na⁺, Mg²⁺, Mn²⁺, Co²⁺, а також органічні сполуки – проміжні продукти обміну речовин в організмі.

Активатором амілази є натрію хлорид (NaCl), інгібітором –купруму сульфат (CuSO₄). Показником впливу цих сполук на активність амілази є ступінь гідролізу крохмалю під дією ферменту в присутності NaCl та CuSO₄.

Матеріальне забезпечення: 1 % р-н крохмалю, 0,1 %-й розчин йоду в 0,2%-му розчині йодиду калію, 5 % р-н CuSO₄, 1 %-й розчин NaCl, розведена слина, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Слину розводять в 2 рази. Беруть 3 пробірки. В пробірку № 1 наливають 1 мл води, в пробірку № 2 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1% -го розчину NaCl, в пробірку № 3 – 0,8 мл води та 0,2 мл 1 %-го розчину CuSO₄. У всі три пробірки додають по 1 мл слини. Вміст перемішують і додають по 2 мл 1 % -го розчину крохмалю, знову перемішують і ставлять в термостат чи на водяну баню при t = 37°C на 15 хв.

Далі у всіх пробірках проводять реакцію з йодом (0,1 %-й розчин йоду в 0,2 %-му розчині йодиду калію). Спостерігають зміну забарвлення.

Результати роботи заносять у таблицю:

Вміст пробірок	№ пробірки
Вода, мл		0,8	0,8
NaCl, 1 %-й розчин, мл	---	0,2	---
CuSO4, 5 %-й розчин, мл	---	---	0,2
Слина (розведення 1:2), мл
Крохмаль, 1 %-й розчин, мл
Забарвлення після додавання йоду

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Інгібітори ферментів широко використовуються в медицині в якості лікарських засобів, зокрема ацетилсаліцилова кислота (аспірин) – інгібітор циклооксигенази (простагландинсинтази) використовується як протизапальний препарат, трасилол – інгібітор трипсину та контрикал – інгібітор протеїназ (зокрема калікреїнів) використовуються при панкреатиті, алопуринол – інгібітор ксантиноксидази застосовується при подагрі, тощо.

Принцип методу. Фосфорорганічні сполуки (ФОС, фосфакол) є незворотними інгібіторами холінестерази та ацетилхолінестерази, оскільки ковалентно зв’язуються з активним центром ферменту і гальмують його активність. Препарати ФОС є високотоксичними отрутами для комах (пестициди) та теплокровних тварин. Механізм гальмівної дії полягає у зв’язуванні з ОН-групою серину в активному центрі ферменту.

При проведенні нервового збудження відбувається зростання концентрації іонів Са²⁺ у нервовому закінченні, що є сигналом для активації виходу ацетилхоліну у синаптичну щілину, взаємодії його з холінорецепторами постсинаптичної мембрани та розщепленням ацетилхолінестеразою. Окрім цього, іони кальцію є потужним активатором холінестерази.

Метод кількісного визначення холінестерази ґрунтується на титруванні лугом ацетатної кислоти, що вивільнилась в процесі гідролізу ацетилхоліну.

Кількість лугу, що затратилась на титрування є мірою активності ферменту.

Матеріальне забезпечення: 0,5 % розчин CaCl₂, 0,5 % розчин фосфаколу, 2 %-й розчин ацетилхоліну, 0,1 М NaOH, розчин фенолфталеїну, сироватка крові, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. Три пробірки заповнюють реактивами за таблицею.

Вміст пробірок	№ пробірки
Сироватка крові, мл	0,5	0,5	0,5
0,5 % розчин CaCl2, кіл-сть крапель	---		---
0,5 % розчин фосфаколу, кіл-сть крапель	---	---
Інкубація при кімнатній температурі, 5 хвилин
2 % розчин ацетилхоліну, мл	1,5	1,5	1,5
Інкубація 10 хвилин, 37 ° С
Фенолфталеїн, кіл-сть крапель
Кількість 0,1 М NaOH, що пішла на титрування, мл

Зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Холінестераза каталізує реакцію гідролізу нейромедіатора – ацетилхоліну з утворенням холіну та ацетатної кислоти. В крові людини міститься два види холінестерази. В сироватці міститься неспецифічна ацилхолінестераза (КФ 3.1.1.8), яка розщеплює не лише ацетилхолін, але й інші ефіри холіну. В еритроцитах міститься специфічна, істинна ацетилхолінестераза, яка розщеплює лише ацетилхолін (КФ 3.1.1.7).

У норміактивність холінестеразив сироватці крові становить 44,4 – 94,4 мккат/л (колориметричним методом за гідролізом ацетилхолінхлориду).

Фізіологічно активні сполуки, що є інгібіторами ацетилхолінестерази, мають важливе фармакологічне та токсикологічне значення, оскільки спричиняють значне підвищення концентрації нейромедіатора як в структурах центральної нервової системи, так і в організмі в цілому.

Зворотні інгібітори ацетилхолінестерази застосовуються в медицині з метою збільшення активності холінергічної імпульсації, порушеної при певних неврологічних захворюваннях, таких як атонія кишківника, сечового міхура. Із зазначеною метою застосовуються препарати: Прозерин, Фізостигмін, Галантамін.

Незворотні інгібіториацетилхолінестерази є потужними нервовими отрутами, які спричиняють різке збудження нервової системи із судомами, порушенням функції серцево-судинної, гастро-інтестинальної та інших фізіологічних систем організму. Найбільш поширеними незворотними інгібіторами є фосфорорганічні сполуки – ФОС. В сільському господарстві для боротьби зі шкідливими комахами використовують: хлорофос, дихлофос, метафос, карбофос, тощо. Нервово-паралітичними отрутами, що використовуються як бойові отруйні речовини є табун, зарин, зоман, тощо. Висока чутливість холінестерази до дії фосфорорганічних сполук робить її специфічним біохімічним маркером для виявлення впливу цих отрут на організм людини.

Дата добавления: 2014-11-25