Дослід 1. Виділення мітохондрій із м’язів шляхом диференційного центрифугування (демонстрація)

Практична робота

Теоретичні питання

Тема № 6. Обмін речовин і енергії. Дослідження функціонування циклу трикарбонових кислот.

Мета заняття: Засвоїти послідовність реакцій та біологічне значення циклу трикарбонових кислот, як універсального кінцевого шляху окисного катаболізму клітини. Оволодіти методами дослідження функціонування ЦТК мітохондрій та впливу малонової кислоти на перебіг його реакцій.

Актуальність теми: Вивчення особливостей функціонування циклу трикарбонових кислот є важливим для визначення його ролі у енергозабезпеченні клітини та пояснення його амфіболічної природи. Вміння аналізувати роль ЦТК необхідні для розуміння обміну речовин та енергії у клітині.

Конкретні завдання:

Ø Трактувати біохімічні закономірності перебігу обміну речовин: катаболічні, анаболічні, амфіболічні шляхи метаболізму;

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції процесів анаболізму та катаболізму;

Ø Трактувати біохімічні закономірності функціонування циклу трикарбонових кислот, його анаплеротичні реакції та амфіболічну сутність;

Ø Пояснювати біохімічні механізми регуляції циклу трикарбонових кислот та його ключову роль в обміні речовин та енергії.

1. Поняття про обмін речовин та енергії. Характеристика катаболічних, анаболічних та амфіболічних шляхів метаболізму, їх значення.

2. Екзергонічні та ендергонічні біохімічні реакції; роль АТФ та інших макроергічних фосфатів у їх спряженні.

3. Внутрішньоклітинна локалізація метаболічних шляхів, компартменталізація метаболічних процесів в клітині. Виділення субклітинних структур методом диференційного центрифугування.

4. Етапи катаболізму біомолекул: білків, вуглеводів, ліпідів; їх характеристика.

5. Найважливіші метаболіти шляхів обміну білків, вуглеводів, ліпідів (піруват, ацетил-S-КоА); їх роль в інтеграції метаболізму клітини.

6. Цикл трикарбонових кислот (ЦТК): внутрішньоклітинна локалізація ферментів ЦТК; послідовність реакцій ЦТК; характеристика ферментів та коферментів ЦТК; реакції субстратного фосфорилування в ЦТК; вплив алостеричних модуляторів на регуляцію ЦТК; енергетичний баланс циклу трикарбонових кислот.

7. Механізми регуляції ЦТК. Анаплеротичні реакції ЦТК.

Принцип методу. Клітини м’язової тканини містять велику кількість спеціалізованих субклітинних органел – мітохондрій. Саме в мітохондріях відбуваються реакції циклу трикарбонових кислот (ЦТК), тканинного дихання та окисного фосфорилування. Ферменти ЦТК локалізовані в матриксі мітохондрій, а компоненти дихального ланцюга локалізовані на внутрішній мембрані мітохондрій.

Для виділення мітохондрій м’язову тканину розтирають (гомогенізують) у механічному гомогенізаторі з тефлоновим наконечником, додаючи розчин сахарози. Виділення мітохондрій з гомогенату здійснюють на рефрижераторній центрифузі. Швидкість осадження клітинних компонентів під дією відцентрової сили залежить від їх маси, розміру, а також часу центрифугування.

Матеріальне забезпечення: свіжі м’язи кроля; розчин № 1 – середовище для виділення мітохондрій (0,25 М розчин сахарози і 0,01 М розчин етилендіамінтетраацетатної кислоти (ЕДТА – для зв’язування кальцію, рН = 7,6); розчин № 2 – середовище для отримання суспензії мітохондрій (0,25 М розчин сахарози в 0,02 М розчині трис-буфера з рН = 7,5). Всі розчини охолоджують до + 2^оС.

Хід роботи. Тканину м’язівочищають від жиру, подрібнюють, зважують та гомогенізують в десятикратному об’ємі охолодженого розчину № 1 протягом 40 хв при швидкості обертання – 600 об/хв. Всі подальші процедури проводять при температурі + 1-2^оС. Гомогенат звільняють від ядер та уламків клітинних мембран шляхом центрифугування впродовж 6 хв при 700 об/хв. Отриману надосадову рідину (супернатант) переносять в інші центрифужні пробірки та повторно центрифугують протягом 10 хв при 7000 об/хв.

Після видалення надосадової рідини отримують осад мітохондрій. Для очищення мітохондрій, додають вихідну кількість розчину № 1, осад ресуспендують, а потім проводять повторне осадження мітохондрій протягом 10 хв при 7000 об/хв. Осад мітохондрій ресуспендують в невеликому об’ємі розчину № 2, визначають вміст білка.

Отриману суспензію мітохондрій використовують для проведення дослідів 2 – 4, а також для дослідження процесів тканинного дихання та окисного фосфорилування.

Дата добавления: 2014-11-25