Дослід 3. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення атомів водню та вплив малонової кислоти на цей процес

Дослід 2. Дослідження функціонування ЦТК мітохондрій за швидкістю утворення СО2 та вплив малонової кислоти на цей процес.

Принцип методу. Перетворення ацетил-S-КоА в присутності мітохондрій, що містять ферменти ЦТК, супроводжується виділенням СО₂. Як джерело ацетил-S-КоА, що вступає в ЦТК, використовують піровиноградну кислоту (ПВК). ПВК під дією мультиферментного піруватдегідрогеназного комплексу мітохондрій піддається окисному декарбоксилуванню з утворенням ацетил-S-КоА.

Якщо блокувати ЦТК малонатом (малоновою кислотою), то СО₂ не утворюється і бульбашки газу не виділяються. Малонат є класичним конкурентним інгібітором сукцинатдегідрогенази – ферменту ЦТК, оскільки зв’язується з її активним центром та перешкоджає зв’язуванню субстрату – сукцинату (бурштинової кислоти).

Для зв’язування СО₂, що утворюється, в інкубаційне середовище додають Са(ОН)₂. Після закінчення інкубації, зв’язаний СО₂ визначають за виділенням бульбашок газу, що утворюються після додавання до інкубаційного середовища сульфатної кислоти.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин Са(ОН)₂, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H₂SO₄, термостат, штатив із пробірками, піпетки

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	2,0	2,0	2,0
Розчин пірувату натрію, мл	0,5	0,5	0,5
Малонова кислота, мл	–	–	0,5
Фізіологічний розчин, мл	0,5	0,5	–
Розчин Са(ОН)2, мл	0,5	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій, мл	–	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння, мл	0,5	–	–
Інкубація в термостаті: 15 хв при температурі 37^оС
0,1 М розчин H2SO4, мл	1,0	1,0	1,0
Результати: виділення бульбашок СО2

Всі пробірки поміщають в термостат на 15 хв при 37^оС. Після інкубації в кожну пробірку додають по 1,0 мл 0,1 М розчину H₂SO₄ і спостерігають за вивільненням бульбашок СО₂.

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Принцип методу. При окисненні ацетил-S-КоА в ЦТК вивільняється водень, який відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку. Час, протягом якого відбувається знебарвлення розчину, є показником інтенсивності протікання ЦТК в мітохондріях.

При блокуванні ЦТК малонатом (малоновою кислотою), вивільнення водню не відбувається і метиленова синька не знебарвлюється.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин пірувату натрію, малонова кислота, фізіологічний розчин, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, термостат, штатив із пробірками, піпетки

Хід роботи. Три пробірки – контрольну, дослідну № 1 та дослідну № 2 заповнюють реактивами згідно таблиці:

Вміст пробірок	Пробірки
Контроль	Дослід №1	Дослід №2
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	2,0	2,0	2,0
Розчин пірувату натрію, мл	0,5	0,5	0,5
Малонова кислота, мл	–	–	0,5
Фізіологічний розчин, мл	0,5	0,5	–
Суспензія мітохондрій, мл	–	0,5	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння,мл	0,5	–	–
Розчин метиленової синьки, мл	0,5	0,5	0,5
Інкубація в термостаті при температурі 37^оС
Результати: інтенсивність знебарвлення метиленової синьки (колір розчину)

Зробити висновки.

Дата добавления: 2014-11-25