Контроль виконання лабораторної роботи. Дослід 4. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій

Дослід 4. Визначення активності ФАД-залежної сукцинат-дегідрогенази – компонента дихального ланцюга мітохондрій.

Принцип методу. Сукцинатдегідрогеназа каталізує дегідрогенізацію сукцинату (бурштинової кислоти), в результаті чого утворюється фумарат (фумарова кислота). Кофактором ферменту є ФАД, який відновлюється в процесі реакції до ФАДН₂. Утворений в реакції ФАДН₂ відновлює метиленову синьку та перетворює її в безбарвну лейкосполуку.

Матеріальне забезпечення: фосфатний буфер рН 7,4, розчин бурштинової кислоти, розчин метиленової синьки, суспензія мітохондрій, 0,1 М розчин H₂SO₄, термостат, штатив із пробірками, піпетки.

Хід роботи. Дві пробірки – контрольну та дослідну заповнюють реактивами згідно таблиці:

Вміст пробірок	Пробірка
Контрольна	Дослідна
Фосфатний буфер, рН = 7,4, мл	1,0	1,0
Розчин бурштинової кислоти, мл	1,0	1,0
Суспензія мітохондрій, мл	–	0,5
Суспензія мітохондрій після кип’ятіння, мл	0,5	–
Метиленова синька, мл	0,5	0,5
Інкубація в термостаті при 37^оС
Результати: інтенсивність знебарвлення метиленової синьки (колір розчину)

За результатами проведеного експерименту зробити висновки.

Клініко-діагностичне значення. Багато речовин, у тому числі і лікарські засоби, можуть змінювати енергетику клітин, інтенсивність окислювального фосфорилування – утворення АТФ. Їх можна поділити на активатори та інгібітори енергетичного обміну. До активаторів належать кислоти циклу Кребса (лимонна, яблучна, бурштинова) та низка інших сполук (глюкоза, амінокислоти тощо), тому вони знайшли застосування у медичній практиці.

Лимонну кислоту у вигляді солей (цитрат натрію) використовують як засіб, що запобігає згортанню крові та може входити до складу деяких ліків.

1. Як можна довести функціонування ЦТК? Принцип визначення активності ферментів ЦТК. Довести функціонування ЦТК за використанням ацетил-S-КоА, за утворенням СО₂, за вивільненням з проміжних продуктів атомів водню.

2. В інкубаційне середовище, де були сукцинатдегідрогеназа і бурштинова кислота, додали малонову кислоту. Як зміниться активність ферменту? Яким чином можна позбавитись негативного впливу малонової кислоти? Намалюйте графік залежності активності сукцинатдегідрогенази від концентрації субстрату без малонової кислоти та в її присутності.

3. До якого класу та підкласу ферментів належать ферменти ЦТК?

4. Як визначити активність сукцинатдегідрогенази мітохондрій. До якого класу та підкласу ферментів належить цей фермент? Пояснити принцип методу.

5. Мітохондрії – субклітинні органели, що містяться в цитоплазмі всіх клітин за винятком зрілих еритроцитів, бактерій, синьо-зелених водоростей. Який основний метод застосовують для їх виділення?

А. Диференційне центрифугування

В. Хроматографію

С. Електрофорез

D. Спектрофотометрію

Е. Гель-фільтрацію

6. Принцип визначення активності сукцинатдегідрогенази базується на відновленні метиленового синього відновленою формою коферменту. Який кофермент входить до складу сукцинатдегідрогенази:

А. ТПФ

В. НАД

С. ФМН

D. ФАД

Е. ПАЛФ

7. Яка з вказаних сполук використовується як інгібітор для дослідження функціонування циклу трикарбонових кислот?

А. АТФ

В. НАД⁺

С. Аконітат

D. Ізоцитрат

Е. Малонат

8. Пацієнт поступив у стаціонар з діагнозом цукровий діабет І типу. Серед метаболічних змін має місце зниження швидкості синтезу оксалоацетату. Який метаболічний процес порушується в результаті цього? Які енергетичні втрати будуть спостерігатися при порушенні цього метаболічного процесу. Вказати, які метаболічні шляхи можуть активуватись для компенсації втрати енергії.

Приклади тестів “Крок-1”

1. Ферменти циклу трикарбонових кислот здійснюють окиснення ацетил-КоА, що супроводжується відновленням 3 молекул НАД⁺ та однієї молекули ФАД. Де вони локалізуються?

А. На плазматичній мембрані

В. В цитоплазмі

С. На зовнішній мембрані мітохондрій

D. В матриксі мітохондрій

Е. На внутрішній мембрані мітохондрій

2. До лікарні потрапив хворий з ознаками отруєння арсеном. Порушення якого процесу має місце, якщо відомо, що миш’як блокує ліпоєву кислоту?

А. Біосинтезу жирних кислот

В. Окисного декарбоксилування a-кетоглутарової кислоти

С. Знешкодження супероксидних аніонів

D. Спряження окиснення і фосфорилування

Е. Мікросомального окиснення

3. Субстратне фосфорилування – це процес безпосередньої передачі молекули активного фосфату із субстратів, які містять макроергічний зв'язок, на АДФ з утворенням АТФ. Вкажіть, який фермент циклу лимонної кислоти бере участь у реакції субстратного фосфорилування?

А. Цитратсинтаза

В. Сукцинатдегідрогеназа

С. Фумараза

D. Сукцинілтіокіназа

E. α-Кетоглутаратдегідрогеназний комплекс

4. Яка речовина є основним джерелом енергії (паливом) для функціонування циклу трикарбонових кислот?

Дата добавления: 2014-11-25