Состав растворов

Компоненты Количество

Фосфатно-солевой буфер (ФСБ)

Калий фосфорнокислый однозамещенный 0,21 г

Натрий хлористый 9 г

Натрия фосфат двузамещенный 0,726 г

Деионизированная вода до 1000 куб. см

Цитратный буфер (pH 5,0)

Лимонная кислота 7,3 г

Натрия фосфат двузамещенный 11,86 г

Дистиллированная вода до 1000 куб. см

Раствор трипсин/Версена

Раствор трипсина в ФСБ (Sigma) 5 г

Раствор Версен (Sigma) 0,2 г

Натрий хлористый 0,85 г

Деионизированная вода до 1000 куб. см

Лизирующий буфер для эритроцитов

Аммоний хлористый 8,3 г

Tris-HCl 1,21 г

Деионизированная вода до 1000 куб. см

Градиент плотности фиколл-верографин плотностью 1,077

Фиколл 9,66 г

Верографин, 76% раствор в ампулах (Sigma) 20 куб. см

Дистиллированная вода 132 куб. см

Лизирующий буфер для теста МТТ

Додецилсульфат натрия 10 г

Соляная кислота 1 H 1 куб. см

Дистиллированная вода До 100 куб. см

Натрий-цитратный буфер (pH 5,5)

Цитрат натрия 25,5 г

Дистиллированная вода До 100 куб. см

Раствор люминола

Люминол 17,7 мг

Человеческий сывороточный альбумин 50 мг

Буфер HEPES (Sigma) 596 мг

Дистиллированная вода До 100 куб. см

4.9.2. Оценка цитотоксичности путем определения активности лактатдегидрогеназы

Лактатдегидрогеназа (LDГ) является стабильным цитозольным ферментом. При повреждении

клеточной мембраны (клеточный лизис или некроз) LDГ высвобождается во внеклеточное

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

пространство. Таким образом, по активности LDГ в бесклеточном супернатанте можно судить о

количестве погибших клеток. Активность LDГ определяют колориметрическим методом с

использованием набора CytoTox 96 фирмы Промега.

Принцип метода определения активности LDГ основан на

способности LDГ

+ +

восстанавливать лактат в пируват, превращая при этом NAD в

HADH/H.

Активность LDГ определяется в два этапа. На первом этапе LDГ

катализирует

+ +

превращение лактата в пируват и восстановление NAD в NADH/H. На

втором

+

этапе фермент диафораза, используя образовавшийся на первом этапе

NADH/H,

катализирует восстановление желтой соли тетразолия INT в красный

формазан.

Таким образом, по интенсивности окраски можно судить об

активности

внеклеточной LDГ. Негативное воздействие наноматериалов

оценивают по

величине их воздействия на целостность мембран клеток,

измеряемой по

активности появляющейся во внеклеточной среде LDГ.

В качестве клеток-мишеней используют клетки перевиваемых

линий,

указанные в разделе 4.9.1. Подготовку клеток к эксперименту,

разведение и

внесение образцов наноматериалов проводят, как в разделе 4.9.1.

Через 24, 48, 72, 96 и 120 часов после добавления

препаратов

наноматериалов из каждой лунки отбирают 0,05 куб. см

супернатанта для

измерения активности LDГ. Реагент Mix substrat из набора,

содержащего

+

лактат и NAD, смешивают с равным количеством реагента assay

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

buffer,

содержащего фермент диафоразу. 0,05 куб. см этой смеси вносят в

каждую

лунку плоскодонного 96-луночного планшета. Туда же вносят по 0,05

куб. см

исследуемого супернатанта. Планшет инкубируют 30 мин. при

комнатной

температуре. Через 30 мин. определяют интенсивность

окрашивания по

оптической плотности раствора на планшетном фотометре при длине

волны

490 нм.

Оценку результатов теста проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и

контрольных лунках. Величина оптической плотности пропорциональна количеству погибших

клеток. Достоверность разницы оптической плотности опытного образца по сравнению с контролем

определяют по критерию Стьюдента. Негативное воздействие наноматериала на жизнеспособность

клеток считается выявленным при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

4.9.3. Оценка цитотоксичности путем определения концентрации АТФ в лейкоцитах

АТФ является маркером жизнеспособности клеток и необходимым компонентом для

поддержания жизнеспособности клеток; ее наличие необходимо для всех метаболических процессов

внутри клетки. Уровень АТФ строго регулируется в здоровых клетках и резко уменьшается, когда

клетки погибают. Например, быстрое уменьшение концентрации АТФ происходит в случае апоптоза

или некроза клеток, поэтому определение концентрации АТФ является индикатором

цитостатического или пролиферационного воздействия на клетку. Для проведения исследования

используют тест-набор ATP Determination Kit (A22066), Invitrogen или аналог.

В качестве клеток-мишеней можно использовать как клетки перевиваемых линий, так и

первичные культуры клеток, полученные от лабораторных животных. Подготовку клеток к

эксперименту, разведение и внесение образцов наноматериалов проводят, как указано в разделе 4.8.1.

Приготовление реагентов:

1) Приготовление реакционного буфера

0,5 куб. см 20-кратного глицинового буфера (содержащего 500 мМ

глицина,

100 мМ MgSO, 2 мМ ЭДТА и 2 мМ азида натрия, pH 7,8)

растворить

в 9,5 куб. см деионизованной воды.

2) Приготовление раствора субстрата (10 мМ D-люциферин)

1 куб. см рабочего раствора реакционного буфера добавить во флакон, содержащий 3 мг

лиофилизированного D-люциферина. Хранить в темноте до использования в течение не более 2

недель при температуре -20 °C.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

3) Приготовление 100 мМ раствора дитиотреитола (ДТТ)

25 мг ДТТ растворить в 1,6 куб. см дистиллированной воды. Разлить в микропробирки по 100

куб. мм, хранить при температуре -20 °C от 6 до 12 месяцев. Размороженный раствор держат на льду

или при -4 °C до использования.

4) Приготовление стандарта АТФ

Раствор АТФ низкой концентрации готовится из готового 5 мМ раствора АТФ в ТЕ буфере

(Sigma). Концентрация и объем раствора зависят от чувствительности люминометра и объема лунки

используемого планшета. Обычно готовят стандарты АТФ с концентрациями от 1 нМ до 1 мкМ.

Стандарт можно хранить несколько недель при температуре -20 °C.

5) Приготовление реакционного раствора

0,5 куб. см 20-кратного буфера из готового реакционного набора (5 мг/куб. см люциферазы в 25

мМ трис-ацетате, 0,2 М сульфата аммония, 15% глицерола и 30% этиленгликоля, 0,1 куб. см 100 мМ

ДТТ, 0,5 куб. см 10 мМ D-люциферина, 2,5 куб. см рекомбинантной люциферазы, pH 7,8) растворить

в 8,9 куб. см дистиллированной воды. Аккуратно перемешать, не встряхивая резко, т.к. фермент легко

может денатурировать. Готовый раствор можно хранить несколько дней при 2 - 6 °C в темноте.

6) Приготовление стандартов

Для построения калибровочной кривой, позволяющей определить количество АТФ в

испытуемом растворе, приготавливают серию двукратных разведений известного количества АТФ в

растворе.

Проведение реакции

Для тестов in vivo используют лейкоциты, выделенные из животных

сразу

после их обработки аэрозолями наноматериалов, как описано в разделе

4.2, и

лейкоциты интактных животных, которые инкубируют с

различными

концентрациями наноматериалов, как описано в разделе 4.8.1. В этом

случае

образцы инкубируют 18 - 24 ч при 37 °C в присутствии 5% CO во

влажной

атмосфере (тест in vitro). Реакционный раствор вносят по 0,1

куб. см в

лунки 96-луночного планшета. В контрольных лунках измеряют

фоновую

люминесценцию реакционного раствора. В опытные лунки вносят по 0,1

куб. см

клеточной взвеси с концентрацией 1 x 10 кл./куб. см. В лунки

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

стандартов

вносят по 0,09 куб. см питательной среды и 0,01 куб. см

разведений

стандарта АТФ, как описано в разделе 4.8.1.

Планшет устанавливают в плашечный термостатируемый универсальный сканер

флюоресцентных сигналов Victor (Perkin Elmer) и производят измерения.

Оценку результатов теста проводят путем сопоставления концентрации АТФ в лунках,

содержащих опытные и контрольные (не подвергнутые действию наноматериалов) клетки. По

степени снижения концентрации АТФ в опытных лунках судят о цитотоксической активности

препарата. Достоверность разницы опыта по сравнению с контролем определяют по критерию

Стьюдента. Искомое воздействие наноматериала на жизнеспособность клеток считается выявленным

при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

4.9.4. Оценка влияния наноматериалов на функциональную активность макрофагов

Тестирование наноматериалов осуществляется путем определения их влияния на различные

функции макрофагов: продукцию активных форм кислорода, активность ферментов, участвующих в

"респираторном взрыве", способность к дифференцировке моноцитов в зрелые макрофаги, уровень

синтеза провоспалительных цитокинов (в частности, фактора некроза опухоли-альфа).

Определение уровня активных форм кислорода по уровню восстановления нитросинего

тетрозолия в НСТ-тесте

Для оценки респираторного взрыва в макрофагах наиболее простым и в то же время очень

надежным является НСТ-тест. Принцип метода заключается в способности супероксидных

радикалов, образующихся при активации макрофагов, восстанавливать нитросиний тетразолий (НСТ)

до образования нерастворимых окрашенных зерен диформазана. Таким образом, по интенсивности

накопления кристаллов диформазана в цитоплазме можно судить об уровне синтеза супероксида, что

является показателем функциональной активности фагоцитов. Безопасность наноматериалов

оценивают по величине их ингибирующего эффекта на синтез активных форм кислорода.

В качестве клеток-мишеней используют мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A,

первичные мышиные перитонеальные и альвеолярные макрофаги, нейтрофилы периферической

крови человека. Клетки J774.1A и мышиные макрофаги культивируют в ППН на основе DMEM. Для

эксперимента используют суточные клетки J774.1A, как описано в разделе 4.7.2, первичные

мышиные макрофаги получают не более чем за сутки до начала анализа, как описано в разделах 4.3,

4.7.1.

Нейтрофилы периферической крови культивируют в ППС на основе РПМИ-1640 и получают в

день эксперимента, как описано в разделе 4.7.1.

Образцы наноматериалов и контроль разводят и вносят в культуры клеток, как указано в разделе

4.8.1. Через 24 и 48 часов после добавления образцов наноматериалов клетки-мишени отмывают от

среды культивирования раствором Хенкса без фенолового красного и добавляют к ним раствор НСТ

в ФСБ с концентрацией 1 мг/куб. см по 0,1 куб. см в лунку. Одновременно с НСТ добавляют

активаторы респираторного взрыва. В качестве активаторов используют опсонизированный зимозан

и/или активатор протеинкиназы C форболмиристат ацетат (ФМА). Для приготовления

опсонизированного зимозана его суспендируют в ФСБ в концентрации 20 мг/куб. см и кипятят на

водяной бане 30 минут, затем дважды центрифугируют в ФСБ, убирают супернатант и добавляют к

осадку соответствующую сыворотку крови (к мышиным клеткам - мышиную сыворотку от 10 мышей,

к человеческим - смешанную человеческую сыворотку от 10 доноров) до конечной концентрации

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

зимозана в сыворотке - 20 мг/куб. см. Смесь инкубируют 45 минут при 37 °C, периодически

встряхивая, затем трижды отмывают раствором ФСБ и ресуспендируют в нем до концентрации 20

мг/куб. см.

ФМА для активации фагоцитов используют в концентрации 100 нг/куб. см в ФСБ.

В опытные лунки добавляют по 50 куб. мм суспензии

опсонизированного

зимозана или раствора ФМА, а в контрольные - по 50 куб. мм раствора

Хенкса

без фенолового красного. Планшет инкубируют 30 минут в стандартных

условиях

(37 °C, 5% CO, 95% влажности). После инкубации клетки с

образовавшимися в

цитоплазме зернами диформазана осторожно, но тщательно трижды

отмываются от

раствора НСТ и зимозана раствором Хенкса без фенолового красного.

Планшет

высушивают и клеточный монослой растворяют до 80 °C

диметисульфоксидом

(ДМСО) по 100 куб. мм на лунку. Определяют интенсивность

окрашивания по

оптической плотности раствора на планшетном фотометре при длине

волны

540 нм.

Оценку результатов теста проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и

контрольных лунках. Величина оптической плотности коррелирует с уровнем продукции

супероксида. По изменению оптической плотности судят о наличии негативного влияния

наноматериала на синтез активных форм кислорода. Достоверность разницы оптической плотности в

опытных лунках по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента. Негативное

воздействие наноматериала на функциональную активность клеток считается выявленным при

установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

Определение спонтанной и индуцированной хемилюминесценции

"Респираторный взрыв" в фагоцитах может быть оценен также путем измерения спонтанной и

индуцированной активаторами (опсонизированным зимозаном или ФМА) хемилюминесценции.

Принцип метода основан на способности кислородных радикалов вызывать хемилюминесценцию -

слабое свечение, которое существенно усиливается люминофорами - люминолом, люцигенином и др.

Первый преимущественно позволяет идентифицировать образование перекиси водорода и

гипохлорной кислоты, второй - супероксидного радикала. При взаимодействии с активными

формами кислорода люминофоры переходят в возбужденное состояние и при возвращении в

исходное испускают квант света, регистрируемый с помощью люминометра.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

В качестве клеток-мишеней используют мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A,

первичные мышиные перитонеальные и альвеолярные макрофаги, нейтрофилы периферической

крови человека. Клетки J774.1A и мышиные макрофаги культивируют в ППН на основе DMEM. Для

эксперимента используют суточные клетки J774.1A, как описано в разделе 4.7.2, первичные

мышиные макрофаги получают не более чем за сутки до начала анализа, как описано в разделах 4.3,

4.7.1. Все манипуляции с клетками проводят, как в случае НСТ теста (см. выше).

Образцы наноматериалов и контроль разводят и вносят в культуры

клеток,

как указано в разделе 4.8.1. Через 24 и 48 часов после добавления

образцов

наноматериалов клетки отмывают от среды культивирования ФСБ и

добавляют к

ним по 50 куб. мм активатора (опсонизированного зимозана или

раствора ФМА,

-6

приготовленных, как указано выше) и 50 куб. мм 10 М раствора

люминола

(таблица 2). Раствор люминола готовят в день опыта, не хранят.

Примечание: поскольку феноловый красный, находясь в реакционной среде, обладает

способностью подавлять (тушить) окисление люминола, реакция хемилюминесценции выполняется

в отсутствие этого индикатора. Разливание среды и добавление клеток выполняют при красном

свете.

Помещают планшеты в планшетный сканер флюоресцентных и люминесцентных сигналов и

проводят измерение хемилюминесценции при 37 °C в 0,1-минутные интервалы на протяжении 90 -

120 минут, фиксируя динамику числа импульсов в минуту (CPM) в виде кривой. Результат

хемилюминесценции оценивается по максимальному значению на кинетической кривой,

построенной счетчиком. Измеряется спонтанная (без активатора) и индуцированная (с активатором)

хемилюминесценция. По значению CPM судят об уровне синтеза активных форм кислорода и о

наличии негативного влияния на него наноматериала. Достоверность разницы хемилюминесценции

в опытных лунках по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента. Искомое

воздействие наноматериала на функциональную активность клеток считается выявленным при

установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

4.9.5. Определение активности ферментов, участвующих в "респираторном взрыве"

Определение активности миелопероксидазы в фагоцитирующих клетках

Принцип метода основан на способности фермента фагоцитов миелопероксидазы разлагать

перекись водорода с образованием кислородных радикалов. Система миелопероксидазы является

одной из самых мощных бактерицидных систем фагоцитирующей клетки. При участии

миелопероксидазы происходит образование таких бактерицидных агентов, как перекись водорода,

гипохлорная кислота и другие. Определение активности миелопероксидазы в фагоцитирующих

клетках является одним из наиболее существенных тестов, позволяющих судить о бактерицидной

активности фагоцитов.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

В качестве клеток-мишеней используют мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A,

первичные мышиные перитонеальные и альвеолярные макрофаги, нейтрофилы периферической

крови человека. Клетки J774.1A и мышиные макрофаги культивируют в ППН на основе DMEM. Для

эксперимента используют суточные клетки J774.1A, как описано в разделе 4.7.2, первичные

мышиные макрофаги получают не более чем за сутки до начала анализа, как описано в разделах 4.3,

4.7.1.

Образцы наноматериалов и контроль разводят и вносят в культуры

клеток,

как указано в разделе 4.8.1. Через 24 и 48 часов после добавления

образцов

наноматериалов клетки отмывают от среды культивирования раствором

Хенкса

без фенолового красного, добавляют к ним по 0,05 куб. см в

лунку

опсонизированного зимозана (см. раздел 4.9.4) и инкубируют 30

минут в

стандартных условиях (37 °C, 5% CO, 95% влажности). После этого

клеточный

монослой дважды отмывается раствором Хенкса без фенолового

красного и

тестируется на активность миелопероксидазы.

Непосредственно перед тестированием готовят раствор ортофенилендиамина (ОФД) в

цитратном буфере (pH 5,0) с концентрацией 0,4 мг/куб. см. Далее 100 куб. мм 33% перекиси водорода

разводят 10 куб. см дистиллированной воды до 0,33% концентрации. Затем 0,5 куб. см 0,33%

перекиси водорода добавляют в 10 куб. см раствора ОФД и полученный раствор вносится в лунки с

монослоем фагоцитирующих клеток по 0,1 куб. см. Планшет инкубируется при комнатной

температуре 10 минут, затем реакция останавливается добавлением 10% серной кислоты (по 100 куб.

мм на лунку). Интенсивность окрашивания регистрируют по оптической плотности раствора при

длине волны 490 нм на планшетном спектрофотометре против контрольной лунки, в которой

используют раствор ОФД и серной кислоты без клеток. Величина оптической плотности

пропорциональна активности миелопероксидазы. Таким образом, измеряется спонтанная (без

активатора) и индуцированная (с активатором) активность фермента миелопероксидазы.

Добавлением тестируемых наноматериалов оценивается их негативное действие на активность

фермента миелопероксидазы. Каждый тест выполняется в трех повторах. Достоверность разницы

оптической плотности в опытных лунках (клетки, обработанные наноматериалом) и в контрольных

лунках определяют по критерию Стьюдента. Искомое воздействие наноматериала на активность

миелопероксидазы считается выявленным при установлении различия на уровне значимости P <

0,05.

Определение активности кислой фосфатазы в фагоцитирующих клетках

Принцип метода основан на способности фермента кислой фосфатазы гидролизовать субстрат

паранитрофенилфосфат с образованием цветного продукта. Кислая фосфатаза - один из ключевых

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

ферментов бактерицидности фагоцитирующей клетки, содержащийся в азурофильных гранулах.

Активность фермента определяет способность клетки к перевариванию и экстрацеллюлярному

киллингу бактериальных агентов.

В качестве клеток-мишеней используют мышиные макрофагоподобные клетки J774.1A,

первичные мышиные перитонеальные и альвеолярные макрофаги, нейтрофилы периферической

крови человека. Клетки J774.1A и мышиные макрофаги культивируют в ППС на основе DMEM. Для

эксперимента используют суточные клетки J774.1A, которые высевают, как описано в разделе 4.7.2,

или первичные мышиные макрофаги, которые получают не более чем за сутки до начала анализа, как

описано в разделах 4.3, 4.7.1.

Образцы наноматериалов и контроль разводят и вносят в культуры

клеток,

как указано в разделе 4.8.1. Через 24 и 48 часов после добавления

образцов

наноматериалов клетки отмывают от среды культивирования раствором

Хенкса

без фенолового красного, добавляют к ним по 50 куб. мм в

лунку

опсонизированного зимозана (см. раздел 4.9.4) и инкубируют 30

минут в

стандартных условиях (37 °C, 5% CO, 95% влажности). После этого

клеточный

монослой дважды отмывают раствором Хенкса без фенолового

красного и

тестируют на активность кислой фосфатазы.

Непосредственно перед тестированием готовят раствор паранитрофенилфосфата, для чего 90 мг

паранитрофенилфосфата и 0,31 г NaCl растворяют в 37 куб. см натрий-цитратного буфера, (раствор

хранится в холодильнике не более 7 - 10 дней).

Перед постановкой реакции раствор паранитрофенилфосфата инкубируют 5 минут при 37 °C. В

лунки плоскодонного 96-луночного планшета, содержащие клетки, вносится по 0,05 куб. см раствора

паранитрофенилфосфата. Реакция проводится при 37 °C 30 минут, останавливается добавлением 0,2

М раствора NaOH по 0,1 куб. см на лунку.

Интенсивность окрашивания регистрируют по оптической плотности раствора при длине

волны 405 нм на планшетном фотометре против контрольной лунки, в которой используют раствор

паранитрофенилфосфата и NaOH без клеток. По величине оптической плотности судят об активности

кислой фосфатазы. Таким образом измеряется спонтанная (без активатора) и индуцированная (с

активатором) активность фермента кислой фосфатазы. По изменению активности фермента

оценивается негативное действие на него тестируемых наноматериалов. Каждый тест выполняется в

трех повторах. Достоверность разницы оптической плотности в опытных лунках (клетки,

обработанные наноматериалом) и в контрольных лунках определяют по критерию Стьюдента.

Негативное воздействие наноматериала на активность миелопероксидазы считается выявленным

при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

4.9.6. Оценка влияния наноматериалов на ФМА-индуцированную дифференцировку

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

моноцитарных клеточных культур в макрофаги

Метод основан на способности суспензионных моноцитарных клеточных культур под влиянием

некоторых агентов (например, активатора протеинкиназы C ФМА) дифференцироваться в зрелые

макрофагоподобные клетки, приобретая при этом способность к адгезии к абиотическим

поверхностям (стекло, пластик), как и все зрелые макрофаги. Таким образом, по количеству

адгезированных клеток судят о глубине клеточной дифференцировки. Количество адгезированных

клеток оценивается методом МТТ, изложенным в разделе 4.9.1. Количество фиолетового формазана в

адгезированном клеточном монослое пропорционально количеству дифференцировавшихся клеток.

Безопасность наноматериалов оценивают по величине негативного эффекта наночастиц на

дифференцировку клеток-мишеней.

В качестве модельной системы используют перевиваемые суспензионные культуры

человеческих моноцитарных клеток THP-1 и HL-60.

Клеточные линии THP-1 и HL-60 культивируют в ППС на основе

РПМИ-1640.

Для эксперимента клетки переносят в 96-луночный плоскодонный

планшет для

культур клеток в ППС в концентрации 2 - 5 x 10

клеток/куб. см

по 0,1 куб. см в лунку. Дифференцировку клеток THP-1 и HL-60 в

макрофаги

индуцируют добавлением в ППС активатора

протеинкиназы C

форболмиристилацетата (ФМА) в конечной концентрации 30 нг/куб. см и

затем

культивируют в течение 3 дней в стандартных условиях (37 °C, 5% CO

, 95%

влажности).

Образцы наноматериалов разводят в ППС, как указано в разделе 4.8.1, и добавляют в клеточную

суспензию одновременно с ФМА по 0,05 куб. см в лунку. По истечении срока инкубации лунки

осторожно, но тщательно трижды отмывают от неприлипших (недифференцированных) клеток

раствором Хенкса без фенолового красного. Количество прикрепленных к пластику клеток

определяют в тесте МТТ, как описано в разделе 4.9.1.

Каждое тестирование проводят в трех повторах. Оценку результатов проводят путем

сопоставления оптической плотности в опытных и контрольных лунках. Величина оптической

плотности пропорциональна количеству дифференцированных макрофагов. Достоверность разницы

оптической плотности по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента. Искомое

воздействие наноматериала на дифференцировку клеток считается выявленным при установлении

различия на уровне значимости P < 0,05.

4.9.7. Оценка влияния наноматериалов на продукцию макрофагами фактора некроза опухоли-

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

альфа

Одним из важных звеньев функциональной активности фагоцитирующих клеток является

способность к передаче клеточных сигналов, приводящих к синтезу провоспалительных цитокинов,

основным из которых является фактор некроза опухоли-альфа (ФНО-альфа). Уровень синтеза ФНО-

альфа определяют методом ИФА и с помощью ФНО-чувствительной клеточной линии мышиных

фибробластов L929.

Определение продукции фактора некроза опухоли (ФНО-альфа) с помощью ФНО-

чувствительной клеточной линии L929

Принцип метода основан на чувствительности мышиных фибробластов L929 к токсическому

действию ФНО-альфа в присутствии актиномицина D. В качестве модельной клеточной системы для

синтеза ФНО-альфа используют культуру мышиных макрофагоподобных клеток J774.1A, в качестве

клеток-мишеней - культуру мышиных фибробластов L929.

Мышиные фибробласты L929 и макрофагоподобные клетки

J774.1A

культивируют в ППС на основе DMEM. Для эксперимента клетки

пересевают в

соответствии со стандартной процедурой (раздел 4.7.2) в 96-

луночный

плоскодонный планшет для культур клеток в ППС в

концентрации

2 x 10 клеток/куб. см по 100 куб. мм в лунку. Образцы

наноматериалов

разводят в ППС, как указано в разделе 4.8.1.

В качестве активатора синтеза ФНО-альфа используют липополисахарид (ЛПС) Escherichia coli в

конечной концентрации 100 нг/куб. см, которая является субоптимальной для активации синтеза

ФНО-альфа макрофагами. Тест ставится в два этапа. На первом этапе индуцируют синтез ФНО-альфа

макрофагами J774.1A в присутствии ЛПС и наночастиц. На втором этапе оценивают количество

ФНО-альфа в супернатанте макрофагов.

К монослою макрофагов в лунки 96-луночного планшета

добавляют

по 0,05 куб. см ЛПС E. coli до конечной концентрации 100

нг/куб. см

и 0,05 куб. см разведенных наночастиц. Планшет культивируют при

37 °C,

5% CO и 95% влажности. Через 24 и 48 часов отбирают супернатант

макрофагов

и используют для определения количества ФНО-альфа в тесте на

фибробластах

L929.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Для этого к монослою фибробластов L929 в лунки 96-луночного

планшета

добавляют по 0,05 куб. см полученных супернатантов и 0,05 куб. см

раствора

актиномицина D до конечной концентрации 1 мкг/куб. см. Планшет

культивируют

при 37 °C, 5% CO и 95% влажности 24 часа.

Для определения изменения продукции фактора некроза опухоли (ФНО-альфа) с помощью

ФНО-чувствительной клеточной линии L929 через 24 часа определяют количество погибших клеток

L929 с помощью теста МТТ, как описано в разделе 4.9.1. Каждый тест выполняют в трех повторах.

Величина оптической плотности пропорциональна концентрации ФНО-альфа в супернатанте

макрофагов. Достоверность разницы оптической плотности по сравнению с контролем определяют

по критерию Стьюдента. Негативное воздействие наноматериала на образование ФНО-альфа

считается выявленным при установлении различия на уровне значимости P < 0,05.

Определение продукции фактора некроза опухоли (ФНО-альфа) методом ИФА

Принцип метода основан на выявлении комплекса антиген-антитело с помощью

ферментативной реакции окисления субстрата (ОФД). Степень окисления субстрата оценивается

колориметрически, по интенсивности окраски судят о количестве ФНО-альфа в клеточном

супернатанте. В качестве модельной клеточной системы для синтеза ФНО-альфа используют

культуру мышиных макрофагоподобных клеток J774.1А.

Клетки J774.1A культивируют в ППС на основе DMEM. Для

эксперимента

клетки пересевают в соответствии со стандартной процедурой (раздел

4.7.2)

в 96-луночный плоскодонный планшет для культур клеток в ППС в

концентрации

2 x 10 клеток/куб. см по 100 куб. мм в лунку. Образцы

наноматериалов

разводят в ППС, как указано в разделе 4.8.1.

В качестве активатора синтеза ФНО-альфа используют ЛПС в

конечной

концентрации 100 нг/куб. см.

К монослою макрофагов в лунки 96-луночного планшета

добавляют

по 0,05 куб. см ЛПС до конечной концентрации 100 нг/куб.

см и

0,05 куб. см разведений наночастиц. Планшет культивируют при

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

37 °C,

5% CO и 95% влажности. Через 24 и 48 часов отбирают супернатант

макрофагов

и используют для определения количества ФНО-альфа с

помощью

иммуноферментной тест-системы на основе моноклональных антител.

Реакцию ставят в 96-луночном полистироловом планшете из тест-системы с

адсорбированными мышиными моноклональными антителами к ФНО-альфа. Дважды промывают

каждую лунку планшета 200 куб. мм буфера для промывания из состава набора (ФСБ + 0,05% твин

20).

Калибровочный стандарт и исследуемые образцы супернатанта разводят буфером для

разведения на основе ФСБ согласно инструкции к набору. Вносят по 0,1 куб. см разведенного

стандарта в лунки планшета в двух повторах (первые два ряда). В остальные лунки планшета вносят

по 0,1 куб. см исследуемых образцов супернатанта в дубликатах. Далее во все лунки вносят по 0,1

куб. см раствора биотинилированного коньюгата МАТ, разведенного буфером для разведения

согласно инструкции к набору. Герметично закрывают планшет липкой лентой и инкубируют при

встряхивании на шейкере при комнатной температуре 2 часа.

Удаляют содержимое лунок, трижды промывают лунки 200 куб. мм буфера для промывания и

вносят в каждую лунку по 0,1 куб. см коньюгата проявляющего субстрата со стрептавидином,

разведенного буфером для разведения согласно инструкции к набору. Инкубируют планшет при

комнатной температуре 10 - 20 минут, пока интенсивность окраски минимальных разведений

калибровочного стандарта не достигнет значений оптической плотности при 450 нм - 0,8 - 0,9.

Останавливают реакцию добавлением 0,1 куб. см стоп-раствора. Измеряют интенсивность

окрашивания по оптической плотности на планшетном фотометре при длине волны 450 нм против

контрольных лунок. В качестве контроля используют лунки, содержащие только ППС и конъюгат

МАТ.

Оценку результатов теста проводят путем сопоставления оптической плотности в опытных и

контрольных лунках. Величина оптической плотности пропорциональна количеству ФНО-альфа. В

присутствии ЛПС оценивают индуцированный синтез ФНО-альфа, а без него - спонтанный уровень

синтеза ФНО-альфа. Безопасность наноматериалов оценивают по негативному влиянию на

спонтанный и индуцированный уровень синтеза ФНО-альфа макрофагами.

Каждый тест выполняют в трех повторах. Достоверность разницы оптической плотности

опытного образца по сравнению с контролем определяют по критерию Стьюдента. Негативное

воздействие наноматериала на жизнеспособность клеток считается выявленным при установлении

различия на уровне значимости P < 0,05.

Дата добавления: 2014-11-25