На лейкоциты периферической крови человека

----------------------T-----------------T----------------T-----------

-----

¦ Клеточная взвесь ¦ Питательная среда ¦ Наноматериал ¦

Наноматериал ¦

¦ 6 ¦ ¦ (высокая ¦

(низкая ¦

¦ 1 x 10 кл./куб. см ¦ ¦ концентрация) ¦

концентрация) ¦

+---------------------+-----------------+----------------+-----------

-----+

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,110 куб. см ¦

¦ ¦

+---------------------+-----------------+----------------+-----------

-----+

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦

¦ ¦

+---------------------+-----------------+----------------+-----------

-----+

¦ 0,100 куб. см ¦ 0,100 куб. см ¦ ¦ 0,010 куб.

см ¦

L---------------------+-----------------+----------------+-----------

------

Планшеты инкубируют 24 ч при 37 °C, 5% CO во влажной

атмосфере.

Клеточную взвесь в каждой лунке тщательно перемешивают и

переносят по

0,1 куб. см маркированные пробирки для проведения

цитофлюориметрического

анализа Falcon. Добавляют 7-AAD и CD45 ФИТЦ из расчета по 0,005

куб. см

раствора красителей на 1 x 10 клеток. Инкубируют 30 минут при

+4 °C в

темноте.

При необходимости лизируют эритроциты. Для этого в каждую пробирку вносят по 1 куб. см 1

X Facs Lysing Solytion (BD), аккуратно перемешивают на вортексе в течение 10 сек., инкубируют 10 -

12 минут в темноте при комнатной температуре (18 - 20 °C).

Осаждают лейкоциты центрифугированием при 300 g 5 минут. Удаляют надосадочную

жидкость. Дважды отмывают лейкоциты в ФСБ (300 куб. мм), 400 g, 5 минут.

Лейкоциты фиксируют путем добавления к ресуспендированной клеточной взвеси по 500 куб.

мм 1% раствора параформальдегида, образцы встряхивают на вортексе.

Анализ проводят на проточном цитофлюориметре в программе Cell Quest Pro.

Цитотоксичным считается наноматериал, индуцирующий гибель более

чем 18%

лейкоцитов через 18 - 24 ч после совместной инкубации in vitro при

37 °C

при 5% CO во влажной атмосфере.

4.11.5. Определение цитолитической активности лимфоцитов

Литическая активность естественных киллеров - один из показателей иммунного статуса.

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

Естественные киллеры - это несенсибилизированные большие гранулярные лимфоциты,

осуществляющие независимый от антител и комплемента лизис широкого спектра клеток-мишеней -

опухолевых, зараженных вирусами, поврежденных клеток. Естественные киллеры играют важную

роль в иммунном надзоре за состоянием клеточной пролиферации и цитодифференцировки.

В качестве клеток-эффекторов (КЭ) используют спленоциты линейных

мышей

Balb/c, выделенные из групп контрольных мышей и групп,

обработанных

анализируемым наноматериалом. Для этого выделяют клетки селезенки,

лизируют

эритроциты, готовят клеточную суспензию 1,5 x 10 кл./куб. см, как

описано

в разделе 4.7.1.

В качестве клеток-мишеней (КМ) используют эмбриональные

мышиные

фибробласты линии Balb/3T3 (линия 3T3) или клетки эритробластоза

человека -

К-562 (1,3 x 10 кл./куб. см), подготовленные к анализу, как

описано в

разд. 4.7.2. В лунки 96-луночного планшета раскапывают клетки-

эффекторы и

клетки-мишени по указанной ниже схеме:

1 лунка 2 лунка Контроль Контроль

(соотношение (соотношение клеток- клеток-

КМ:КЭ = 1:10) КМ:КЭ = 1:15) эффекторов мишеней

Спленоциты 0,080 куб. см 0,080 куб. см 0,080 куб. см -

К-562 (или 3T3) 0,080 куб. см 0,120 куб. см - 0,080 куб. см

Полная среда RPMI 0,040 куб. см - 0,120 куб. см 0,120 куб. см

(без сыворотки)

Инкубируют планшеты 4 ч при 37 °C в условиях 5% CO во

влажной

атмосфере. Добавляют в лунки контролей по 0,007 куб. см 1%

бромистого

этидиума (на дистиллированной воде), инкубируют 30 минут при 4

°C. На

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

цитофлюориметре определяют процент жизнеспособных клеток. Живые

клетки с

целостной мембраной не окрашиваются красителем. В контрольных

лунках

жизнеспособность спленоцитов в норме должна составлять не

менее 95%,

жизнеспособность клеток-мишеней - не менее 87%.

Для оценки цитолитической активности естественных киллеров из лунок, содержащих клетки-

мишени и клетки-эффекторы, отбирают по 0,070 куб. см клеточной взвеси в двух повторах.

Добавляют по 200 куб. мм раствора Версена.

Затем готовится окрашивающий раствор, состоящий из 0,007 куб. см 1% раствора (на

дистиллированной воде) тритона X100, 0,005 куб. см РНК-азы и 0,007 куб. см 1% бромистого

этидиума.

На цитофлюориметре анализируют процент спленоцитов с гиподиплоидным содержанием

ДНК, используя программу Cell Quest.

Коэффициент литической активности рассчитывают по формуле:

n - n

1 2

K = ------- x 100%,

c n

где:

K - коэффициент литической активности;

c

n - количество гиподиплоидных клеток в 1-ой лунке

(соотношение

КМ:КЭ = 1:10);

n - количество гиподиплоидных клеток во 2-ой лунке

(соотношение

КМ:КЭ = 1:15).

Достоверное снижение/увеличение цитолитической активности лимфоцитов, выделенных от

животных, обработанных наноматериалом, по сравнению с цитолитической активностью

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

лимфоцитов, выделенных от интактных животных, свидетельствует об ингибировании/активации

наноматериалом литической активности естественных киллеров.

4.11.6. Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов животных

Фагоцитоз является одной из важнейших реакций, обеспечивающих как естественную

резистентность организма (неспецифический иммунитет), так и представление антигена,

необходимое для развития специфического иммунного ответа. Нарушения на различных этапах

фагоцитоза приводят к развитию многочисленных патологических состояний.

Анализ фагоцитарной активности можно проводить, используя коммерческий набор Phagotest,

BD или с применением приготовленных ФИТЦ-меченых бактерий (например, E. coli - ФИТЦ).

Для этого штамм E. coli HB 101 выращивают в среде LB (1% триптон, 0,5% дрожжевой экстракт

и 1% раствор хлорида натрия) на возвратном вибраторе (150 об./мин.). После культивирования в

течение ночи при 37 °C бактерии осаждают центрифугированием при 1500 g, дважды промывают

ФСБ и один раз дистиллированной водой. Бактерии инактивируют нагреванием в течение 60 мин.

на водяной бане при 56 °C.

Инактивированные клетки E. coli (1 x 10 клеток/куб. см)

отмывают в

0,15 М фосфатном буфере. Инкубируют в 2,5 куб. см

0,1 М

карбонат-бикарбонатного буфера, pH 9,0 (0,15 М NaCl, 0,5 М NaHCO,

0,5 M

Na CO), содержащего 500 мкг изомера 1-флуоресцеинизотиоцианата

(ФИТЦ) в

2 3

течение 60 мин. при 4 °C.

Клетки перемешивают, энергично промывают 2 - 3 раза охлажденным на льду 0,15 М

фосфатным буфером и 1 раз дистиллированной водой, каждый раз осаждая клетки

центрифугированием (1500 g).

Меченные ФИТЦ клетки E. coli можно хранить в малом количестве сбалансированного солевого

раствора Хенкса, pH 7,4 при температуре минус 20 °C в течение 2 месяцев.

Для оценки фагоцитоза меченные ФИТЦ клетки E. coli

суспендируют в

сбалансированном солевом растворе Хенкса. Перитонеальные макрофаги

вносят в

пробирки по 0,1 куб. см в разведении 1 x 10 кл./куб. см. Перед

добавлением

ФИТЦ-меченных бактерий макрофаги инкубируют на льду в течение 10

мин. для

Не является официальной версией, бесплатно предоставляется членам Ассоциации лесопользователей Приладожья, Поморья и Прионежья – www.alppp.ru. Постоянно действующий третейский суд.

того, чтобы охладить их до 0 °C. Тщательно перемешивают охлажденные

ФИТЦ-

меченные клетки E. coli и добавляют их в объеме 0,01 куб. см к

взвеси

макрофагов. Пробирки встряхивают. Контрольные пробы оставляют на

льду.

Исследуемые пробы инкубируют 10 мин. при температуре +37 °C на

водяной

бане.

Для подавления флуоресценции непоглощенных макрофагами бактерий непосредственно перед

окончанием времени инкубации достают все образцы одновременно из водяной бани и помещают их

на лед для того, чтобы остановить фагоцитоз. В каждую пробирку добавляют по 0,1 куб. см ФСБ,

содержащего 1% азид натрия (или Quenching Solution, BD). Пробирки встряхивают.

Добавляют по 3 куб. см ФСБ в каждую пробирку. Перемешивают содержимое пробирок

встряхиванием. Осаждают клетки центрифугированием (5 мин. при 250 g, +4 °C). Удаляют

супернатант. Отмывают образцы еще один раз, добавив 3 куб. см ФСБ.

Лизируют эритроциты. При использовании FACS Lysing Solution, BD концентрированный

лизирующий раствор предварительно разводят деионизованной водой в 10 раз. В каждую пробирку

вносят по 2 куб. см рабочего лизирующего раствора, смешивают на вортексе и инкубируют в темноте

10 - 12 минут (не больше!) при температуре +20 - 25 °C. Осаждают макрофаги центрифугированием

(200 - 300 g, 5 минут). Встряхивают осадок на вортексе и отмывают макрофаги в 2 куб. см ФСБ с 0,1%

азидом натрия. Осаждают макрофаги центрифугированием (200 - 300 g, 5 минут). Повторяют

процедуру отмывки. Вносят в каждую пробирку по 0,5 куб. см ФСБ с 0,1% азидом натрия и

диспергируют клетки.

Для фиксации макрофагов в каждую пробирку вносят по 0,5 куб. см 1% раствора

параформальдегида и встряхивают на вортексе. Препараты можно хранить до проведения анализа

при температуре +2 - 4 °C не более 24 часов.

Измеряется общее количество фагоцитирующих макрофагов (поглощение одной или более

бактерий одним макрофагом) с использованием программы Cell Quest.

Оценку влияния наноматериала на функцию фагоцитоза проводят, сравнивая фагоцитарную

активность макрофагов, выделенных от обработанных наноматериалом мышей и интактных

животных. Снижение фагоцитарной активности макрофагов мышей, обработанных наноматериалом,

свидетельствует о снижении естественной резистентности организма.

Дата добавления: 2014-11-25