Практичне заняття №16

Тема: «Морфологія і ультраструктура вірусів. Культивування вірусів

Віруси є етіологічним чинником великої групи інфекційних захворювань, різноманітних за клінічними проявами та перебігом, які характеризуються високою контагіозністю та здатністю викликати епідемії та пандемії. На даний час вірусологія, ще нещодавно будучи вузькою дисципліною, є однією з медико-біологічних дисциплін, що інтенсивно розвиваються.

Важливість вірусології зумовлена, насамперед, провідною роллю вірусів в інфекційній патології людини. Їх питома вага зростає по мірі зниження захворюваності бактеріальними, грибковими та протозойними інфекціями на фоні обмеженості засобів специфічної хіміотерапії. По-друге, на моделях вірусів (як найбільш просто організованих форм життя) вирішують багато фундаментальних питань біології та молекулярної генетики (наприклад, вчення про інтрони, сплайсинг та онкогени). Одним з найбільших вкладів вірусології в сучасну науку вважають відкриття зворотної транскриптази, використання якої лежить в основі генної інженерії.

Знання даної теми є необхідним для розуміння патогенезу вірусних захворювань на клінічних кафедрах. В практичній роботі лікаря це є важливим для клініко-морфологічної диференційної діагностики вірусних і інших інфекційних захворювань. На занятті студентам надається можливість оволодіти методами культивування культур клітин, методом інфікування культур клітин вірусовмісним матеріалом, що є необхідним для формування у студентів уявлення про методи діагностики вірусних захворювань.

· Трактувати морфологію і ультраструктуру вірусів.

· Аналізувати особливості взаємодії вірусів з живими системами.

· Оцінювати результати розмноження вірусів в живих системах.

· Аналізувати методи культивування вірусів в лабораторних умовах.

3. Базові знання, вміння, навички, необхідні для вивчення теми (міждисциплінарна інтеграція)

Назви попередніх дисциплін	Отримані навики

Анатомія людини	Аналізувати інформацію про будову тіла людини, системи, що його складають, органи і тканини
Гістологія, цитологія, ембріологія	Інтерпретувати мікроскопічну та субмікроскопічну структуру клітин

Медична і біологічна фізика	Трактувати загальні фізичні та біофізичні закономірності, що лежать в основі біологічних процесів.
Медична біологія	Пояснювати на молекулярно-біологічному та клітинному рівні закономірності біологічних процесів
Медична хімія	Трактувати загальні фізико-хімічні закономірності, що лежать в основі процесів розвитку клітин

4. Завдання для самостійної роботи під час підготовки до заняття.

4.1. Перелік основних термінів, параметрів, характеристик, які повинен засвоїти студент при підготовці до заняття:

Термін	Визначення

Вірус	Вірус – неклітинна форма живих істот, яка характеризується малими розмірами, відсутністю власних білоксинтезуючих та енергієгенеруючих систем, а також облігатним внутрішньоклітинним паразитизмом. Віруси існують у двох якісно різних формах: позаклітинній – віріон та внутрішньоклітинній – вірус.
Нуклеокапсид	Білковий футляр (капсид), що оточує одну молекулу нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК), разом формують нуклеокапсид. Капсиди утворені з білкових субодиниць (поліпептидів), які називають капсомерами.
Суперкапсид	Суперкапсид (пеплос) – зовнішня оболонка складних вірусів, що містить ліпіди та пронизана вірусоспецифічними білками глікопротеїдами. Структурною субодиницею суперкапсидної оболонки є пепломер.
Продуктивна інфекція	Тип взаємодії вірусу і клітини, при якому вірус функціонує в клітині автономно, а його репродукція відбувається незалежно від репродукції клітинного генетичного апарата. При цьому утворюється нове покоління інфекційних вірусів.

Аборивний тип взаємодії вірусу з клітиною	Аборивний тип взаємодії вірусу з клітиною відбувається тоді, коли цикл репродукції вірусів блокується на одній із стадій, а інфекційні віріони не утворюються.
Інтегративний тип взаємодії вірусу з клітиною	Інтегративний тип взаємодії вірусу з клітиною відбувається тоді, коли з клітиною взаємодіють онкогенні РНК- та ДНК-геномні віруси, а нуклеінова кислота інтегрується в клітинну хромосому та існує там у вигляді провірусу. В результаті може спричинятися зміна спадкових властивостей клітини. Такий процес об’єднання вірусної нуклеїнової кислоти з хромосомою клітини-хазяїна має назву вірогенії.
Дефектні віруси	Дефектні віруси – це віруси, що втратили в процесі репродукції частину свого геному. Їх поділяють на 4 групи: дефектні інтерферуючі частинки, інтегровані геноми, віруси-супутники та псевдовіріони.

· Сучасні погляди на природу і походження вірусів. Місце вірусів у системі живого.

· Історія відкриття і головні етапи розвитку вірусології. Внесок вітчизняних вчених.

· Принципи класифікації вірусів. Основні властивості вірусів людини і тварин.

· Морфологія і ультраструктура вірусів. Типи симетрії вірусів. Хімічний склад, функції складових частин вірусів.

· Репродукція вірусів. Етапи та види взаємодії вірусів з чутливими клітинами.

· Бактеріофаг, історія вивчення. Структура, класифікація фагів за морфологією. Методи якісного і кількісного визначення бактеріофагів. Практичне використання бактеріофагів.

· Форми взаємодії бактеріофагів з бактеріальною клітиною. Вірулентні і помірні фаги. Характеристика продуктивної взаємодії. Лізогенія і фагова конверсія.

4.3. Практичні завдання, які виконуються на занятті:

1. Вивчити морфологічні та структурні особливості вірусів, їх взаємодію з клітинами.

2. Охарактеризувати методи культивування вірусів.

3. Дослідити клітинні культури, їх використання у вірусології, а також поживні середовища для вирощування клітин.

4. Здійснити інфікування клітинних культур вірусовмісним матеріалом. Методи підготовки матеріалу для вірусологічного дослідження.

На практичному занятті студенти знайомляться з методикою забору, обробки та транспортування матеріалу для вірусологічного дослідження, приготуванням матеріалу для інфікування живих систем; вивчають зразки живильних середовищ, розчинів та сироваток, що використовуються при роботі з клітинними культурами; вивчають на демонстраційних препаратах різні види культур клітин, які використовуються у вірусології; порівнюють методи культивування вірусів у різних чутливих системах (клітинних культурах, курячих ембріонах, чутливих лабораторних тваринах); проводять інфікування культури клітин вірусовмісним матеріалом, інфікування курячих ембріонів та лабораторних тварин. Виконані завдання студенти записують у протокол та підписують його у викладача.

1. Тканинні або органні культури
Тканини зародкового органу або його частини, які підтримуються in vitro і зберігають диференціацію клітин і їх функції
2. Клітинні культури
Характеристики	Первинно-трипсинізовані культури клітин	Перещеплювані культури клітин	Диплоїдні культури клітин
Морфологія клітин порівняно з вихідною тканиною	Не відрізняється	Відрізняється	Відрізняється
Набір хромосом	Диплоїдний	Гетероплоїдний	Диплоїдний
Тривалість життя	Обмежена 1-3 пасажами	Не обмежена кількістю пасажів	Обмежена 20-100 пасажами
Ріст в суспензії	Не можливий	Можливий	Не можливий
Ознаки малігнізації	Відсутні	Завжди є	Відсутні
Період генерації	3-7 днів	2/3-1 дні	1-15 днів
Контактне пригнічення при вирощуванні на склі	Є	Відсутнє	Є
Приклади	1. Культура клітин нирок мавп 2. Культура клітин фібробластів ембріона людини 3. Культура клітин фібробластів курячого ембріона	1.HeLa (з карциноми шийки матки) 2. KB (з карциноми ротової порожнини людини) 3.HЕp-2 (карцинома гортані людини) 4. Vero (з нирки зеленої мавпи)	Лінії клітин фібробластів ембріона людини (WI-38, MRC-5, MRC-9, IMR-90), корів, свиней, овець

Класифікація живильних середовищ для культур клітин

Природні	Ферментативні гідролізати	Синтетичні
Середовище Ендерса: 85-90% коров'ячої амніотичної рідині; 5-10% коров'ячого ембріонального екстракту, 5% кінської сироватки	Амінопептид Гемогідролізат Гідролізат лактальбуміну	1.Збалансовані сольові розчини: розчин Ерла, розчин Хенкса, розчин Дульбекко і Фогта 2. Підтримуючі середовища: середовище 199, середовище Ігла, ДМЕМ (середовище Ігла, модифікована Дульбекко), МЕМ (середовище Мельника-Ігла)

Середовища для культури клітин, що застосовують в вірусології, поділяють на 2 основні категорії – ростові та підтримуючі.

Ростові середовища (РС), завдяки високому вмісту сироватки, сприяють швидкому клітинному росту. Після формування моношару та перед інокуляцією вірусу ростове середовище видаляють та замінюють підтримуючим середовищем. Для приготування ростового середовища до живильного середовища (наприклад, ДМЕМ), додають 5-10% сироватки великої рогатої худоби (ВРХ) або ембріональної телячої сироватки (ЕТС) і антибіотики (пеніцилін і стрептоміцин).

Підтримуючі середовища (ПС) з низьким вмістом сироватки дозволяють зберегти культури клітин в стані повільного стійкого метаболізму в період розмноження вірусу.

Завдання №1. На демонстраційних препаратах ознайомитись з різними видами культур клітин, які використовуються у вірусології, замалювати в протокол.

Завдання №2. Ознайомитись та записати в протокол методику підготовки матеріалу для вірусологічних досліджень.

Завдання №3. Здійснити інфікування культур клітин вірусовмісним матеріалом.