План заняття. 1. Вивчити вплив різних температур на активність амілази

1. Вивчити вплив різних температур на активність амілази.

2. Визначити чутливість ферментів до рН середовища.

3. Вивчити вплив активаторів та інгібіторів на активність ферментів.

4. Визначити специфічність дії ферментів.

1. Вивчення впливу різних температур на активність амілази

Фермент амілаза каталізує гідроліз крохмалю до декстринів і мальтози. Такий процес відбувається, наприклад, у ротовій порожнині при вживанні з їжею продуктів, що містять крохмаль: картоплі, хліба, макаронних виробів. Джерелом амілази є слина. Цей фермент знахо-диться і в інших відділах травного тракту, а також у печінці та інших тканинах. Різні типи амілаз використовуються в харчовій промис-ловості, наприклад, у пивоварній, де їх джерелом є рослини (ячмінь).

Дію амілази розпізнають по зникненню синього забарвлення, яке утворюється при додаванні йоду.

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: 1. Термостат, нагрітий до 37^оС;

2. Холодильник;

3. Піпетки на 1...2 мл;

4. Крапельниці;

5. Нагрівальний прилад.

Реактиви: 1. Крохмаль картопляний, 1 %-й розчин;

2. Розчин йоду, 0,1 н, розбавлений безпосередньо перед визначенням до 0,004 н.

Техніка виконання роботи

У 3 пробірки наливають по 1 мл джерела амілази. Першу пробірку кип’ятять протягом не менш, ніж 3 хв., дають охолонути. Потім до всіх 3 пробірок приливають по 1 мл крохмалю. Другу пробірку кладуть у холодильник для охолодження до 10^оС. Третю ставлять у термостат, нагрітий до 37^о С. Через 10…15 хв. до усіх трьох пробірок приливають по 1...2 краплі розчину йоду. Якщо крохмаль не перетравився амілазою, то утворюється синє забарвлення. При наявності продуктів гідролізу колір з йодом стає фіолетовим, червоним або жовтим в залежності від глибини розщеплення та розміру утворених молекул декстринів. Амілодекстрини забарвлюються йодом у фіолетовий колір, ерітродекстрини – у червоний, ахродекстрини – утворюють жовте забарвлення, як і мальтоза. По кольору визначають глибину розщеплення крохмалю.

2. Вивчення чутливості ферментів до рН середовища

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками, закритими пробками;

2. Піпетки на 1...2 мл;

Реактиви: 1. Буферний розчин, рН якого дорівнює 5,0 (10,30 мл О,2 М Na₂HPO₄ 2H₂O змішується з 9,70 0,1 М розчину лимонної кислоти);

2. Буферний розчин з рН 6,8 (15,45 мл 0,2 М Na₂HPO₄ змішується з 4,55 мл 0,1 М розчину лимонної кислоти);

3. Крохмаль, 1 %-й розчин;

4. Розчин йоду в йодистому калії 0,004 н., приготовлений шляхом розбавлення з 0,1 н. безпосередньо перед дослідженням. У такій концентрації, йод забарвлює крохмаль у синій колір і не припиняє дії амілази.

Техніка виконання роботи

У 2 пробірки наливають по 1 мл джерела амілази, в одну з них додають 1 мл буфера з рН 5,0; у другу – 1 мл буфера з рН 6,8. Потім в обидві пробірки приливають по 2 краплі йоду і по 1 мл крохмалю. Пробірки закривають пробками і залишають їх при кімнатній температурі, спостерігають за швидкістю зникнення синього забарвлення в кожній пробі. Відзначають, при якому значенні рН швидше гідролізувався крохмаль.

Примітка: якщо під дією двох крапель йоду крохмаль не посинів, додають ще однакову кількість розчину крохмалю в усі пробірки, доки не з’явиться синє забарвлення.

3. Вивчення впливу активаторів та інгібіторів на активність ферментів

В організмі дія ферментів регулюється різноманітними механізмами: інтенсивністю синтезу каталітичних білків генетичним апаратом, їхнім руйнуванням продуктами реакції каталізу, гормонами і іншими факторами.

Важлива роль належить активаторам та інгібіторам ферментів, які впливають на різні їхні ділянки або беруть участь в утворенні тимчасових комплексів із субстратами.

Активатори та інгібітори дії ферментів використовуються для регуляції відповідних технологічних процесів, наприклад, для заміса тіста, а також, в медичній практиці для припинення життєдіяльності мікроорганізмів або заміщення недостатньої активності ензимів у тканинах, наприклад, у підшлунковому соку.

Об’єкт дослідження: Розчин панкреатину (джерело амілази).

Обладнання і посуд: Штатив із пробірками.

Реактиви: 1. NaCl, 1 %-й розчин;

2. Сірчанокисла мідь, 5 %-й розчин;

3. Розчин йоду у йодистому калії, 0,004 н.;

4. Крохмаль, 1 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

Готують три пробірки. У першу приливають 2,5 мл води, у другу – 2 мл води та 0,5 мл розчину NaCl, у третю – 2 мл води та 0,5 мл розчину CuSO₄. В усі три пробірки вносять по 2,5 мл розчину амілази, перемішують і додають по 1 мл розчину крохмалю, потім знов перемішують і ставлять у термостат при температурі 37⁰ С. Через 5…10 хвилин додають по 5 крапель розчину йоду. Рідина у першій пробірці забарвлюється у фіолетовий або червоний колір, у другій – в червоний або жовтий, у третій – у синій.

4. Визначення специфічності дії ферментів

Ферментам притаманна специфічність дії, оскільки вони здатні каталізувати тільки певні хімічні реакції.

Специфічність дії ферментів буває абсолютна, відносна, групова і стереохімічна.

Ферменти специфічні відносно як типу реакцій, що каталізуються, так і субстратів, на які вони діють. Деяким ферментам притаманна абсолютна специфічність, що виявляється з дії тільки на один будь-який субстрат. Висока специфічність ферментів визначається тим, що тільки деякі строго визначені функціональні групи, що входять до складу ферментів, можуть брати участь в утворенні фермент-субстратних комплексів.

Амілаза слини прискорює гідроліз тільки полісахаридів, не впливаючи на дисахариди. Мальтаза слини прискорює гідроліз дисахарида мальтози, що утворюється при гідролізі крохмалю, але зовсім не впливає на інший дисахарид – сахарозу. Сахароза не має вільної альдегідної групи, тому не дає реакції з реактивом Фелінга. Реакція може бути позитивною тільки в тому разі, якщо сахароза розщепиться на свої складові – глюкозу і фруктозу. Сахарозу розщеплює фермент сахараза на глюкозу і фруктозу і не розщеплює крохмаль та інші дисахариди.

Об’єкт дослідження: 1. Розчин панкреатину (джерело амілази);

2. гідролізат дріжджів.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Термостат або водяна баня 38^оС;

3. Крапельниці;

4. Піпетки.

Реактиви: 1. Сахароза, 1 %-й розчин;

2. Крохмаль, 1 %-й розчин;

3. Їдкий натр, 10 %-й розчин;

4. Сульфат міді, 5 %-й розчин;

5. Реактив Фелінга І;

6. Реактив Фелінга ІІ.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки приливають по 5 крапель 1 мл розчину амілази.У першу пробірку додають 1 мл 1 %-го розчину крохмалю, у другу – 1 мл 1 %-го розчину сахарози. Обидві пробірки ставлять на 10 хв. у термостат або водяну баню при температурі 38^оС, після чого проводять реакцію Фелінга, тобто в обидві пробірки додають 0,5 мл реактиву Фелінга І і 0,5 мл Фелінга ІІ і нагрівають до кипіння.

Позитивна реакція Фелінга має місце в пробірці, де зустрічаються субстрат та відповідний фермент (наприклад, крохмаль та амілаза слини), результатом дії якого є гідроліз. При цій реакції утворюються мальтоза, а потім глюкоза, яка має вільну альдегідну групу, що забезпечує появу червоного осаду закісі міді.

Сахароза не має вільної альдегідної групи і відновлювальними властивостями не володіє, тому не дає реакції з реактивом Фелінга (червоного осаду). Реакція може бути позитивною тільки в тому разі, якщо сахарозу розщепить фермент сахараза на її складові – глюкозу і фруктозу.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 6

«ОКИСНЮВАЛЬНО-ВІДНОВЛЮВАЛЬНІ ФЕРМЕНТИ (ОКСИДОРЕДУКТАЗИ)»

Мета заняття: вивчити вплив різних факторів на активність оксидоредуктаз.

Дата добавления: 2014-12-08