План заняття. 1. Визначити вплив азотної кислоти на розчин білку

1. Визначити вплив азотної кислоти на розчин білку.

2. Провести осадження білків органічними кислотами.

3. Осадити білки іонами важких металів.

4. Провести осадження білків органічними розчинниками.

5. Осадити білки хлоридом натрію.

6. Провести висолювання білків сірчанокислим амонієм.

7. Провести осадження казеїну.

8. Провести осадження білків молока ацетоном.

І. Визначення впливу азотної кислоти на розчини білків

Об'єкт дослідження: Яєчний білок, 10 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1...2 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: Азотна кислота 30 %-а, приготовлена на насиченому розчині хлористого натрію.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають 2 мл азотної кислоти і під кутом 45° обережно по стініці приливають піпеткою розчин білка. На межі обох рідин з'являється біле кільце коагульованого білка.

До суміші кислоти і білка додають воду і впевнюються в незворотності осаджування. Виявлено, що біле кільце на межі кислоти і розчину білка з'являється при його концентрації 0,0033 %. Даний метод використовується для кількісного визначення білка в сечі. Якщо в ній виявлено білок, то цю рідину розбавляють до найменшої концентрації, при якій кільце утворюється. Помножуючи 0,0033 % на розбавлення, знаходять кількість білка в сечі.

2. Осадження білків органічними кислотами

Об'єкт дослідження: Яєчний білок, 10 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1...2мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. Трихлороцтова кислота, 10 %-й розчин;

2. Сульфосаліцилова кислота, 10 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки вносять по 2 мл розчину яєчного білка. В першу додають 1 мл розчину трихлороцтової кислоти, в другу – 1 мл розчину сульфосаліцилової кислоти. В обох пробах спостерігають появу осаду білку.

3. Осадження білків іонами важких металів

Об’єкт дослідження: Яєчний білок, 10 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1...2 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. СuSO₄, 5 %-й розчин;

2. Ацетат свинцю, 5 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

В дві пробірки вносять по 2 мл розчину яєчного білку. В першу додають 1 мл розчину сірчанокислої міді, в другу – 1 мл ацетата свинцю. Спостерігають утворення осаду: в першій пробірці – блакитного кольору, в другій – білого кольору. При додаванні надлишка розчинів сульфата міді та ацетата свинцю спостерігають зникнення осаду внаслідок його розчинення.

4. Осадження білків органічними розчинами

Об'єкт дослідження: Яєчний білок.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1...2 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. Етиловий спирт, 96 %-й;

2. Ацетон, 5 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки вносять по 2 мл яєчного білку. У першу додають 1 мл розчину етилового спирту, у другу – 1 мл розчину ацетону. Спостерігають помутніння розчинів.

5. Осадження білків хлоридом натрію

Об'єкт дослідження: Яєчний білок, 10 %-й розчин.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Піпетки на 1... 2 мл;

3. Крапельниці.

Реактиви: 1. Хлорид натрію;

2. Оцтова кислота, концентрована.

Техніка виконання роботи

У пробірку вносять 3 мл розчину яєчного білка та хлорид натрію до повного насичення. Спостерігають випадіння в осад глобулінів. Суміш фільтрують крізь паперовий фільтр. У фільтраті будуть аль-буміни. Якщо до фільтрату додати 1 мл розчину оцтової кислоти і наг-ріти суміш до кипіння на водяній бані, то альбуміни випадуть в осад.

6. Висолювання білків сірчанокислим амонієм

При дії насиченого розчину сірчанокислого амонію відбувається дегідратація молекул білків і вони коагулюють, оскільки знижується захисна оболонка, яка складається з диполів води. Після розведення водою суміші білків і сірчанокислого амонію знову утворюється їх розчин. Осаджування різних білків починається при неоднаковій концентрації сірчанокислого амонію, а альбумінів – при повному насиченні ним. За допомогою висолювання можна розділити суміш різних білків.

Об'єкт дослідження: Яєчний білок.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Воронки;

3. Піпетка на 2 мл;

4. Фільтри паперові.

Реактиви: 1. Сірчанокислий амоній – насичений розчин;

2. Сірчанокислий амоній кришталевий.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають 2 мл розчину яєчного білка, доливають рівний об'єм насиченого розчину сірчанокислого амонію і перемішують. Випадають в осад глобуліни, альбуміни залишаються в розчині. Осад фільтрують крізь бумажний фільтр. Потім до фільтрату додають кристалевий сірчанокислий амоній до появи мутності. Енергійно струшують пробірку для розчинення солі (остання порція солі вже не розчиняється). Переконавшись в коагуляції альбумінів, додають воду і спостерігають, чи станеться розчинення осаду.

П р и м і т к а. З фільтратом можна провести біуретову реакцію на наявність білків. Якщо відбулось повне осадження білків, то реакція повинна бути негативною.

7. Осадження казеїну

До складу молока входять різні білки: казеїни, лактоглобуліни, альбуміни. За кількістю переважає казеїн. У нейтральному середовищі вони не коагулюють при кип'ятінні, хоча і денатурують. Осадження казеїнів відбувається під впливом молочної кислоти, що утворюється під дією мікроорганізмів у процесі скисання молока. При коагуляції білків молока хлористим кальцієм в осад переходять усі їх фракції. Такий метод використовують, коли готують прісний сир з молока для дітей на молочних кухнях, а також білок молочний харчовий з пахти (відходи, що залишаються при виготовлені масла). Ці продукти в 4-5 разів багатші на кальцій та фосфор, ніж кисломолочний сир.

Об'єкт дослідження: Молоко.

Обладнання і посуд: 1. Нагрівальний прилад;

2. Штатив із пробірками;

3.Крапельниці.

Реактиви: кальцій хлористий, 10 %-й розчин.

Техніка виконання роботи

У пробірку наливають близько 2 мл молока і доводять його до кипіння, потім додають 5...6 крапель хлористого кальцію, спостерігають появу осаду.

8. Осадження білків молока ацетоном (використовується для вивчення свіжості молока)

Ацетон у нерозбавленому вигляді, визиваючи дегідратацію білків, осаджує їх із розчину. Наполовину розбавлений ацетон не викликає коагуляції білків молока. У разі накопичення в молоці кислот стійкість білків почне знижуватись і додавання 50 %-го розчину ацетону викликає їх коагуляцію. Це відбувається при такій кількості кислот у молоці, яка ще не відчувається на смак. Проба з ацетоном використовується для визначення свіжості молока, що особливо важливо для підприємств харчування, які обслуговують дітей, а також для дієтичних їдалень.

Об'єкт дослідження: Молоко свіже.

Обладнання і посуд: 1. Штатив із пробірками;

2. Циліндр на 10 мл.

Реактиви; 1. Ацетон, 50 %-й розчин;

2. Буфер, рН якого дорівнює 5,0 (змішують 10,3 мл 0,2 М розчину Na₂НР0₄ • 2Н₂О із 9,70 мл 0,1 М лимонної кислоти С₆Н₈О₇);

3. Папір індикаторний універсальний.

Техніка виконання роботи

У дві пробірки наливають по 2 мл молока, в одну з них додають рівний об'єм лимоннокислого буфера, доводячи рН суміші до 5,0 (контролюють за допомогою індикаторного папірця). Струшуючи цю пробірку, переконуються у відсутності на стінках коагулянту (крихти на стінках пробірки). Потім в обидві пробірки доливають по 2 мл ацетону, енергійно струшують, спостерігають появу згустків на стінках пробірки.

Контрольні запитання

1. Що таке білки і які їх функції в організмі?

2. Перелічте властивості білків.

3. Яке структурне і функціональне значення гідрофобних, кислих і основних, сульфгідрильних груп в білках?

4. Білки підлягали згорянню, після чого в мінералізаті винайшли залізо. Які білки містять цей елемент?

5. Які класифікації амінокислот Вам відомі?

6. Що таке незамінні амінокислоти і в яких продуктах вони містяться?

7. В суміші амінокислот після гідролізу казеїну за допомогою відповідних реактивів винайдено гідрофільні групи. Які амінокислоти містять їх? Напишіть їх формули.

8. До водного розчину амінокислот доданий універсальний індикатор. Визначена кисла реакція. Яким амінокислотам властиві кислі реакції? Напишіть їх формули.

9. За допомогою відповідних реактивів в розчині білка визначена сірка. Які амінокислоти її містять? Напишіть їх формули.

10. Розкажіть про класифікацію білків.

11. Від чого залежить біологічна цінність білків?

Тема 1.3. Ферменти; будова, властивості, класифікація. Біологічне окиснення

Всі біологічні каталізатори є речовинами білкової природи і носять назву ферментів або ензимів.

Ферменти не являються компонентами реакцій, а лише прискорюють досягнення рівноваги збільшуючи швидкість як прямого, так і зворотного перетворення. Прискорення реакції відбувається за рахунок зниження енергії активації того енергетичного бар'єру, який відокремлює один стан системи (початкову хімічну сполуку) від іншого (продукт реакції).

Ферменти прискорюють самі різні реакції в організмі.

Властивості ферментів.

1. Вплив на швидкість хімічної реакції: ферменти збільшують швидкість хімічної реакції, але самі при цьому не витрачаються.

2. Специфічність дії ферментів. У клітинах організму протікає 2-3 тис. реакцій, кожна з яких каталізується певним ферментом. Специфічність дії ферменту – це здатність прискорювати протікання однієї певної реакції, не впливаючи на швидкість інших, навіть дуже схожих. Специфічність ферментів обумовлена їх унікальною амінокислотною послідовністю, від якої залежить конформація активного центру, що взаємодіє з компонентами реакції. Речовина, хімічне перетворення якої каталізується ферментом носить назву субстрат.

3. Активність ферментів – здатність різною мірою прискорювати швидкість реакції.

Активність залежить в першу чергу від температури. Найбільшу активність той або інший фермент проявляє при оптимальній температурі. Для ферменту живого організму це значення знаходиться в межах (37,0…39,0°С), залежно від виду тварини. При пониженні температури сповільнюється броунівський рух, зменшується швидкість дифузії і, отже, сповільнюється процес утворення комплексу між ферментом і компонентами реакції (субстратами). В разі підвищення температури вище за 40,0…50,0°С молекула ферменту, яка являється білком, піддається процесу денатурації. При цьому швидкість хімічної реакції помітно падає.

Активність ферментів залежить також від рН-середовища. Для більшості з них існує певне оптимальне значення рН, при якому їх активність максимальна. Оскільки в клітині містяться сотні ферментів і для кожного з них існують свої межі оптимуму рН-середовища, тому зміна рН це один з важливих чинників регуляції ферментативної активності.

Механізм дії ферментів. Реакція каталізу складається з трьох послідовних етапів.

1. Утворення фермент-субстратного комплексу при взаємодії через активний центр.

2. Зв’язування субстрату відбувається в декількох точках активного центру, що приводить до зміни структури субстрату, його деформації за рахунок зміни енергії зв'язків в молекулі. Це друга стадія і називається вона активацією субстрату. При цьому відбувається певна хімічна модифікація субстрату і перетворення його в новий продукт або продукти.

3. В результаті такого перетворення нова речовина (продукт) втрачає здатність утримуватися в активному центрі ферменту і фермент-субстратний, вірніше вже фермент-продуктний комплекс дисоціює (розпадається).

Ферментативні регулятори – це речовини, що змінюють швидкість ферментативного каталізу і регулюють за рахунок цього метаболізм. Серед них розрізняють інгібітори – уповільнюючи швидкість реакції і активатори – прискорюючи ферментативну реакцію. Крім інгібіторів відомі ще активатори ферментативного каталізу, вони захищають молекулу ферменту від інактиваційних дій; утворюють із субстратом комплекс, який активніше зв'язується з активним центром ферменту, а також взаємодіючи із ферментом, що має четвертинну структуру, роз'єднують його субодиниці і тим самим відкривають доступ субстрату до активного центру.

Класифікація ферментів.

Ферменти поділяють на такі класи:

1. Оксидоредуктази. Каталізують окислювально-відновні реакції. Діляться на 17 підкласів. Всі ферменти містять небілкову частину у вигляді гема або похідних вітамінів В₂, В₅.

2. Трансферази – каталізують перенесення різних радикалів від молекули донора до молекули акцептора.

3. Гідролази – каталізують реакції гідролізу, тобто розщеплювання речовин з приєднанням по місцю розриву зв'язку води. До цього класу відносяться переважно травні ферменти.

4. Ліази – каталізують реакції розщеплювання молекул без приєднання води. Ці ферменти мають небілкову частину у вигляді тіамінпірофосфату (В₁) і пірідоксальфосфату (В₆).

5. Ізомерази – каталізують реакції ізомеризації.

6. Лігази (синтетази) – каталізують реакції синтезу складніших речовин із простих. Такі реакції йдуть з витратою енергії АТФ. До назви таких ферментів додають «синтетаза».

Біологічне окиснення. У процесі життєдіяльності організми поглинають з навколишнього середовища енергію в адекватній формі, а потім повертають її еквівалентну кількість, але вже в іншому виді. Основним носієм енергії є електрон (е ^-). Одержавши визначену кількість енергії, він збуджується: переходить на більш високий енергетичний рівень. Роблячи зворотний шлях на нижню орбіту, електрон вивільняє таку ж кількість енергії

Для всіх організмів, що живуть на Землі, основним джерелом енергії служить сонячне випромінювання. Існує дві групи організмів, що розрізняються за способом харчування – аутотрофи і гетеротрофи. Автотрофи – (зелені рослини) здатні безпосередньо уловлюва-ти сонячну енергію і використовувати її для створення органічних сполук. Гетеротрофи – це організми, що асимілюють готові органічні речовини, які мають визначений запас потенційної енергії. У процесі їхньої життєдіяльності енергія вивільняється. У живих організмах енергія, що вивільняється при окислюванні, запасається в основному у виді хімічної енергії, що після використання переходить у теплоту. При окислюванні в неживій природі відбувається пряме приєднання кисню. У живій природі втрата гідрогену.

Встановлено, що універсальним резервом хімічної енергії, що утворюється в процесі окислювання органічних речовин у клітинах, є аденозинтрифосфат (АТФ). Ця сполука складається з аденіну, рибози і трьох залишків фосфорної кислоти. Таким чином, вивільнення енергії при окислюванні органічних речовин, на відміну від горіння, відбувається поступово. При цьому не виникають ті значні перепади температури, що характерні для горіння. Незалежно від окремих етапів окисного розщеплення органічних речовин у кінцевому рахунку утворюються ті ж продукти розпаду (СО₂ і Н₂О) і виділяється стільки ж енергії. Таким чином, джерелом енергії в організмі стає реакція між гідрогеном і оксигеном, у результаті чого утворюється вода. Сучасна теорія біологічного окиснювання об'єднала теорії Баха - Варбурга і Паладіна - Віланда на новому рівні розвитку досліджень цієї наукової проблеми. Отже, біологічне окислювання - це процес відщіплення атомів водню або електронів від субстрату і передача їх через ряд проміжних етапів на молекулярний кисень. У цьому процесі беруть участь ферменти: пирідинозалежні дегідрогенази (їх коферментну функцію виконує нікотинамідаденіндинуклеотид – НАД або нікотин-амідаденіндинуклеотидфосфат – НАДФ), флавінозалежні дегідроге-нази – флавінові ферменти (до складу їхньої простетичної групи входить флавінаденіндинуклеотид – ФАД або флавінаденінфосфат – ФАДФ); цитохроми (містять у якості простетичної групи залізопорфіринову кільцеву систему), а також убіхінон (коензим Q) і білки, що містять негемінове залізо.

ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 5

«ВЛАСТИВОСТІ ФЕРМЕНТІВ»

Мета заняття: вивчити властивості ферментів.

Дата добавления: 2014-12-08