Вопросы для повторения. 1. Что представляют собой флуоресцентные белки, принцип применения в КЛСМ

1. Что представляют собой флуоресцентные белки, принцип применения в КЛСМ.

2. Что такое трассирование.

3. При помощи какого метода можно изучать распределение и поступление ионов в клетку.

4. Дайте характеристику следующим методам: FRET, FRAP, FLIM.

5. Какое значение имеют методы флуоресцентной in situ гибридизации.

Приложение 1. Исследования морфофункциональных особенностей биологических объектов при помощи конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

***

Проведено исследование по изучению динамики всасывания в кишечнике и реабсорбции в почке желтого флюоресцентного белка у крыс в постнатальном онтогенезе. Эксперименты выполнялись на крысятах в возрасте 5, 12, 25 сут. и взрослых крысах линии Вистар. Животных наркотизировали введением (внутрибрюшинно) раствора, содержащего 0.75 % нембутала и 0.37 % хлоралозы из расчета 0.5 мл на 100 г массы тела. Для введения флюоресцентного белка в желудочно-кишечный тракт у наркотизированных животных разрезали брюшную стенку по белой линии живота, вскрывали стенку пищевода в нижней его части и через разрез вводили полиэтиленовый зонд. Зонд через желудок продвигали в сторону двенадцатиперстной кишки и по нему вливали раствор YFP (в концентрации 0.0365 мг/мл на 0.01 М PBS-буфере, рН 7.3) из расчета 70 мкл на 100 г веса животного. Затем зонд вынимали, ниже разреза на пищевод накладывали лигатуру и зашивали брюшную стенку. Через 3, 9, 15, 21, 27, 33 мин после введения раствора флюоресцентного белка в просвет кишки брюшная полость животного снова вскрывали, удаляли участок тонкой кишки, который фиксировали для морфологических исследований. Через 20, 30, 60 и 120 мин после введения белка в просвет кишки извлекали почку, печень, выделяли фрагменты этих органов и фиксировали для дальнейших исследований.

Выделенные образцы тканей фиксировали в растворе 4%-ного параформальдегида (Sigma, США) на 0.01 М PBS-буфере, рН 7.3 в течение 2 ч, затем дважды по 15 мин отмывали PBS, после чего пропитывали в 30%-ном растворе сахарозы на PBS в течение 12 ч при температуре 4°С. Для получения гистологических срезов кусочки ткани заключали в криогель (Bright, Англия), замораживали в жидком азоте. Затем готовили срезы толщиной 5—7 мкм в криостате Leica CM1510 (Leica, Германия) при -20 °С. Полученные срезы помещали на покровные стекла, высушивали при комнатной температуре и с помощью раствора глицерина и PBS (в соотношении 1:1) монтировали на предметные стекла. Препараты изучали в микроскопе TSC SL (Leica, Германия) с конфокальной приставкой DM R (Leica, Германия).

В экспериментах был использован YFP (Yellow Fluorescent Protein, мол. масса около 27 000 кДа, 238 аминокислот), полученный в Лаборатории механизмов биосинтеза белка Института белка РАН (Пущино). YFP обладает желто-зеленой флюоресценцией и является генетическим вариантом зеленого флюоресцентного белка, спектр его возбуждения 513, эмиссии 527 нм. Этот маркерный белок характеризуется высокой устойчивостью к протеолитическим ферментам.

Рис. 27. Флюоресценция энтероцитов тонкой кишки крыс на максимуме после введения в ее просвет раствора YFP. Энтероциты крысят в возрасте 5 суток (А) и 12 суток (Б).

В опытах на крысятах в возрасте 5, 12 и 25 сут и взрослых крысах показано, что после введения в желудок желтого флюоресцентного белка (YFP) происходит его частичное всасывание в нерасщепленном виде в тонкой кишке с последующим поступлением с током крови в почку и аккумуляцией в клетках проксимального сегмента нефрона. С увеличением возраста у крыс снижается интенсивность всасывания YFP в кишке; накопление YFP в почке происходит активнее у крысят младших возрастных групп, чем у взрослых животных. В печени накопление YFP не выявляется. Полученные результаты свидетельствуют об интенсивном всасывании в негидролизованном виде YFP в тонкой кишке крысят в раннем постнатальном онтогенезе и о важной роли почек в белковом метаболизме и протеолизе чужеродных белков.

Рис. 28. Флюоресценция клеток проксимального канальца почки крыс через 2 ч после введения в просвет тонкой кишки раствора YFP. Эпителиоциты крысят в возрасте 5 суток (А) и 12 суток (Б).

***

Исследованы механизмы, опосредующие нейротоксическое действие глутамата на нейроны коры головного мозга крыс, развивающиеся в первичной культуре ткани на протяжении 7 дней. Использовали нейроны коры головного мозга, находящиеся в культуре 7 суток. Этот срок культивирования соответствует стадии молодых развивающихся нейронов, способных формировать нейрональную сеть. Во время опыта клетки помещали в физиологический раствор, не содержащий Mg²⁺, следующего состава (ммоль/л): 140 NaCl, 2,8 KC1, 1,0 СаС1₂, 10 Hepes, при рН 7.2—7.4. Глутамат (Glu), глицин (Gly), N-метил-D-аспартат (NMDA), α-амино-3-пропионат (AMPA), каинат (KA), 6-циано-7-нитрохиноксалин-2,3-дион (CNQX, циклотиазид, DL-2-амино-5-фосфонопентоновая кислота (АР5) и Mg²⁺ добавляли в чашки Петри на необходимое время. Глутамат обладает выраженным нейротоксическим действием. Для идентификации гибели нейронов методом флуоресцентной и конфокальной микроскопий использовались витальные флуорохромы акридиновый оранжевый (АО) и этидий бромид (ЭБ). Первоначально после необходимого воздействия нейроны обрабатывали АО в течение 20 с. Затем – ЭБ в течение того же времени. Непосредственно перед конфокальной регистрацией препарат тщательно отмывался для предотвращения автофлуоресценции раствора за счет остаточной концентрации зондов. Возбуждение флуорохромов вызывалось лазерным светом длиной волны 488 нм. Эмиссия АО происходила в зеленой области спектра (максимум приходился на длину волны 525 нм), а ЭБ в красной области (максимум приходился на длину волны 610 нм). Изображение регистрировалось двумя независимыми каналами конфокального микроскопа. Результирующее изображение получалось путем наложения 2 изображений, зарегистрированных в разных (зеленой и красной) областях спектра. Ядра нейронов с деструктурированной мембраной, окрашенные ЭБ, светились красным светом, ядра живых нейронов, окрашенные АО, светились зеленым светом. Для исследований использовали флуоресцентный микроскоп Leica DMK, оборудованный конфокальным сканером Leica ТСS SL (Leiса, Germany). В работе применяли фармакологически активные вещества акридиновый оранжевый, этидий бромид, поли-Д-лизин, трипсин и ДНКазу производства Sigma.

В результате было установлено, что динамика и степень нейродегенерации, вызываемая Glu, достигнутая к окончанию экспериментов, зависела от его концентрации.

Рис. 29. Оценка числа погибших нейронов коры головного мозга крыс методом конфокальной микроскопии. А — нейродегенерация, вызванная действием 30 мкмоль/л NMDA в присутствии 30 мкмоль/л Gly через 300 мин после добавления нейротоксических факторов, окраска АО и ЭБ. Размер кадра 150 X 150 мкм при увеличении х40; Б- те же условия, что и на А, при регистрации через 360 мин.

Например, в присутствии 1 ммоль/л и 10 ммоль/л Glu к 6-му ч регистрации число погибших нейронов составило около 30 и 60 % соответственно. Эффект 1 ммоль/л Glu имел фармакологическую чувствительность, совпадающую с эффектом NMDA: потенцировался Gly, ингибировался АР5 и существенно ослаблялся в присутствии 2 ммоль/л Mg²⁺ в физиологическом растворе. Нейротоксический эффект 3 ммоль/л Glu был резистентным к действию веществ, специфических по отношению к NMDA-R (NMDA рецепторы), т. е., опосредовался активацией других Glu-R (Glu рецепторы).

Для подтверждения этого предположения было изучено нейротоксическое действие АМРА и КА — агонистов AMPA-R (AMPA рецепторы) и KA-R (КА рецепторы). Эффект в присутствии обеих концентраций КА (30 и 300 мкмоль/л) был сходен, и число погибших нейронов к концу эксперимента составило около 55 %. Нейротоксичность 10 мкмоль/л АМРА была выражена слабо, так как число погибших нейронов к 5 ч регистрации не превышало 20 %. Однако добавление 100 мкмоль/л циклотиазида, который снимает десенситизацию AMPA-R, сопровождалось значительным усилением эффекта АМРА, и он становился столь же выраженным, как и эффект КА. При этом CNQX защищал нейроны от гибели как при действии АМРА, так и КА. Полученные данные выявляют две компоненты нейротоксического действия Glu. Эффект низких концентраций опосредуется активацией NMDA-R, а действие высоких определяется предпочтительной активацией AMPA-R и KA-R.

Дата добавления: 2014-11-29