Цели и задачи изучения темы. Вопросы для повторения

Вопросы для повторения

1. Что необходимо учитывать при подготовке образцов для исследования в ПЭМ.

2. Какие требования необходимо предъявлять к фиксаторам образцов для исследования в ПЭМ:

3. Что такое криофиксация?

4. Для чего нужно проводить обезвоживание образца?

5. Как приготовить ультратонкие и полутонкие срезы образцов для изучения в ПЭМ.

6. Чем окрашивают препараты для исследования в ПЭМ?

7. Дайте характеристику методу реплик.

8. Опишите основные принципы метода замораживания травления.

Тема 2.3 Растровая (сканирующая) электронная микроскопия (РЭМ)

Цель: формирование знаний об использовании растровой (сканирующей) электронной микроскопии в биологических исследованиях.

Задачи:

· изучение особенностей конструкции и принципа работы сканирующих электронных микроскопов;

· оценка возможностей применения сканирующей электронной микроскопии в биологических исследованиях.

В современных РЭМ в качестве источника электронов наряду с катодной пушкой используют автоэмиссионную полевую электронную пушку. Электроны, пройдя через систему электромагнитных линз, преобразуются в узкий пучок электронов (диаметром 5-10 нм) — электронный зонд. На своем пути к исследуемому объекту электронный зонд подвергается действию полей, контролируемых генератором развертки, в результате чего зонд осуществляет сканирование поверхности объекта в форме квадратного растра.

Рис. 40. Функциональная схема растрового (сканирующего) электронного микроскопа.

Генератор развертки одновременно связан с электронно-лучевой трубкой (кинескоп), благодаря чему светящееся пятно на экране кинескопа синхронно повторяет движение острия электронного зонда, «прочерчивающего» строку за строкой поверхность объекта.В результате взаимодействия электронного зонда с объектом происходит генерирование ряда различных сигналов, несущих информацию об объекте. С помощью детектора сигнал преобразуется в электрический и после усиления подается на кинескоп, модулируя интенсивность электронного луча в нем. В результате на экране кинескопа возникает изображение поверхности объекта соответствующее виду детектируемого сигнала.

При сканировании поверхности объекта электронный зонд генерирует различные сигналы: вторичные электроны, упругорассеянные электроны, рентгеновское излучение, катодолюминесценцию. В результате столкновения электронов зонда с атомами объекта из последних «выбиваются» электроны, которые покидают объект – вторичные. Эти электроны обладают низкой (не выше 50 эВ) энергией, поэтому вследствие поглощения веществом объекта область их эмиссии ограничивается очень тонким (менее 50 нм) слоем последнего. Главным фактором, определяющим контраст изображения, формируемого при детектировании вторичных электронов, является топография поверхности объекта. Контраст, зависящий от условий сбора вторичных электронов, основан на так называемом эффекте освещенности. Обладающие низкой энергией вторичные электроны нуждаются в «притягивании» к детектору электрическим полем, создаваемым положительным потенциалом, приложенным к детектору. Следуя по криволинейным траекториям из участков эмиссии к детектору, вторичные электроны могут огибать различные препятствия (элементы рельефа), благодаря чему участки поверхности объекта, расположенные за этими препятствиями (внутренние поверхности углублений и впадин и др.) становятся доступными для наблюдения. Упругорассеянные электроны.Это электроны зонда, которые в результате столкновения с ядрами атомов объекта изменили свое направление и вышли из объекта. Они несут как информацию отопографии поверхности объекта, так и сведения о химическом (элементном) составе объекта. Химический состав объекта связан с интенсивностью эмиссии упругорассеянных электронов, которая монотонно возрастает с увеличением среднего атомного номера вещества объекта. Эта зависимость обусловливает создание на поверхности объекта композиционного контраста, т. е. контраста, связанного с вариациями в химическом составе различных участков объекта: участки с более «тяжелыми» элементами будут выглядеть ярче. Топография поверхности объекта соответствует контрасту формируемого изображения, с возрастанием угла падения электронного зонда, при этом интенсивность эмиссии упругорассеянных электронов повышается. При взаимодействии электронов зонда с веществом объекта возникает рентгеновское излучение, которое с помощью специальной аппаратуры может быть детектировано и подвергнуто анализу. На основании спектра характеристического излучения можно судить об элементном составе объекта. Можно определять концентрацию элементов в выбранных точках или вдоль любой линии на поверхности объекта; можно получить картину распределения определенного элемента и сравнить ее с топографической картиной той же области. Электроны, прошедшие через объект могут дать информацию о микроструктуре. Катодолюминесценция – световые фотоны, генерируемые при взаимодействии электронов зонда с объектом, также могут использоваться в качестве сигнала в РЭМ биологических объектов. Люминесценция зависит от молекулярной структуры вещества самого объекта или материалов, искусственно введенных в него. Участки катодолюминесценции выглядят при РЭМ более яркими по сравнению с окружающими участками поверхности объекта.

Для получения качественного изображения в РЭМ важную роль имеет контраст и разрешение. Контраст изображения напрямую зависит от вида детектируемого сигнала, а разрешение от диаметра электронного зонда в месте его встречи с поверхностью объекта.

Дата добавления: 2014-11-29