Цели и задачи изучения темы. Тема 2.2 Подготовка образцов для просвечивающей электронной микроскопии

Тема 2.2 Подготовка образцов для просвечивающей электронной микроскопии

Вопросы для повторения

1. Дайте краткую характеристику ПЭМ.

2. Перечислите основные элементы ПЭМ.

3. Как устроена электронная пушка ПЭМ, какая ее роль?

4. Что такое сферическая и хроматическая аберрации?

5. Какую функцию выполняют детекторы в ПЭМ.

6. Опишите вакуумные системы, устанавливающиеся в ПЭМ.

7. Для чего нужен держатель образцов?

8. Какие биологические объекты можно изучать в ПЭМ.

Цель: формирование знаний о способах подготовки препаратов для просвечивающей электронной микроскопии.

Задачи:

· изучение основных этапов подготовки биологического материала для просвечивающей электронной микроскопии;

· изучение наиболее распространенных методов подготовки биологических образцов.

Электронная микроскопия позволяет глубоко проникнуть в структурное выражение биологических процессов и выяснить закономерности жизнедеятельности клеток и тканей. Однако важно уметь правильно подготовить материал и подобрать правильную методику.

Основные этапы подготовки:

1. взятие материала и фиксация образцов;

2. заливка кусочков и изготовление ультратонких срезов;

3. монтаж срезов на опорные сеточки и контрастирование;

4. изучение срезов в электронном микроскопе и фотографирование электронно-оптических изображений.

Основные проблемы, возникающие при подготовке образцов для исследования в ПЭМ:

1. Воздействие химических и физических факторов при взятии, фиксации и заливке приводящие к артефактам и вызывающие искажения в ультраструктурной организации объектов. К ним относятся: аутолиз, плохая фиксация, полимеризованные повреждения и д.р.;

2. Монохромность электронного луча. Изображение, получаемое в ПЭМ, имеет вид черно-белого фотоснимка. Возникающая контрастность изображения от белого к черному объясняется неодинаковой способностью прохождения электронов через различные структуры объекта. Для получения более качественного изображения в биологические объекты целесообразно, дополнительно вводить вещества, содержащие тяжелые атомы, которые обусловливают возникновение контраста и способствуют получению четкого изображения ультраструктур;

3. Получение ультратонких срезов, так как электронный луч ПЭМ имеет слабую проникающую способность. Если толщина среза превышает более чем в десять раз значение разрешающей способности электронного микроскопа, то разрешающая способность прибора не может быть полностью реализована;

4. Абсолютная чистота при работе с микрообъектами. Частицы пыли, попавшие на препарат, могут перекрыть все изучаемые структуры и внести дополнительный электрический фон, что повлияет на качество изображения.

Взятие материала для ПЭМ. Материал для электронно-микроскопических исследований необходимо брать и фиксировать как можно скорее, желательно даже до наступления клинической смерти животного. При этом все процедуры необходимо осуществлять в условиях низкой температуры при этом размеры объектов, от которых можно получить хорошие срезы, не должны превышать 1 мм.

Химическая фиксация биологических образцов это вещества, которые связываясь с компонентами клеток или тканей, вызывают в их структурах липидную стабилизацию или белковую коагуляцию. При химической фиксации необходимо соблюдать следующие условия:

1. Объем фиксатора должен в 10 раз превышать объем образца;

2. Если при погружении образца в фиксатор последний мутнеет, то его необходимо немедленно заменить.

3. Нельзя переносить образцы из одного флакона в другой с помощью пинцетов. Необходимо использовать пипетки или сливать через край.

4. Знание и строгий контроль скорости проникновения и времени фиксации используемых веществ.

Все фиксаторы использующиеся для электронной микроскопии должны отвечать следующим требованиям:

1) быстро проникать в ткани;

2) сохранять третичную структуру молекул антигенов и их доступность для взаимодействия с антителами;

3) рН, молярность и ионный состав фиксатора должны быть близкими к внеклеточной или внутриклеточной жидкости образца.

Все фиксаторы можно разделить на четыре группы:

1) быстро проникающие и быстро фиксирующие (акролеин);

2) медленно проникающие и медленно фиксирующие (четырехокись осмия);

3) медленно проникающие, но быстро фиксирующие (глютаральдегид);

4) быстро проникающие, но медленно фиксирующие (формальдегид).

Общепризнанно то, что идеальных фиксаторов нет, однако критическими факторами фиксации являются: используемый фиксатор, рН, ионная сила раствора, ионный состав, диэлектрическая константа, осмолярность, температура, длительность фиксации, метод нанесения фиксатора.

Криофиксация (замораживание) биологических образцов - очень быстрое охлаждение, при этом кристаллы льда либо вообще не образуются, либо эти кристаллы достаточно малы, чтобы вызвать существенные структурные повреждения. Так, кусочек ткани размером 0,5 мм охлаждают до температуры ниже – 100⁰С за 0,02 сек. Криофиксация оказывает на образец только физическое влияние.

Криофиксация имеет следующие преимущества:

1) сохраняет нативный состав элементов в объекте;

2) блокирует скоротечные биохимические и морфологические изменения;

3) предупреждает денатурацию белков;

4) дает возможность препарировать и изучать образцы в их естественном состоянии и окружении;

5) делает образцы твердыми, что позволяет изготавливать ультратонкие срезы или сколы.

Для замораживания биологических объект можно использовать: изопентан, пропан, фреон, гелий, или металлический блок охлажденный в жидком азоте (- 196⁰С).

Быстрое замораживание образцов реализуется с помощью ряда приемов:

1) погружение в охлажденную до сверхнизких температур промежуточную жидкость - криоген;

2) разбрызгивание криогена на образец;

3) распыление объекта на охлажденную жидкость;

4) метод «сандвича»;

5) замораживание объекта на охлажденном металлическом зеркале;

6) замораживание при высоком давлении.

В большинстве исследований при замораживании тканевых образцов, обводненных более чем на 50-60 %, чаще всего используют химический способ уменьшения количества свободной воды с помощью криопротекторов. В качестве их обычно применяют глицерин, диметилсульфоксид (ДМСО), сахарозу. Эти вещества, проникая в образец, активно структурируют воду. Для нефиксированных объектов криопротекторы не используются.

Промывка и обезвоживание биологических образцов. Промывку материала от фиксатора следует проводить буферным раствором, который применялся при данной фиксации, в физиологическом растворе или дистиллированной воде. Промывка должна быть кратковременной от 5 до 30 минут в зависимости от объекта. Длительное пребывание образцов в промывочной среде вызывает мацерацию и разрушение ультраструктур.

В связи с тем, что большая часть заливочных сред нерастворима в воде, то появляется необходимость заместить воду в образце промежуточным растворителем (дегидратантом), который хорошо смешивается с водой и с заливочной средой. В качестве дегидратантов применяют этанол, ацетон и метанол. Объем обезвоживающей смеси должен в 10 раз превосходить объем обрабатываемой ткани. Обезвоживание должно быть полным - для этого необходимо, чтобы 100%-ные дегидратанты были абсолютными. Заливка биологических образцов – пропитка заливочным материалом и последующее получение блока с оптимальной для ультрамикротомии твердостью и эластичностью. Основные требования, предъявляемые к заливочным средам. Они должны:

1) быть жидкими в мономерном состоянии, т. е. обладать низкой вязкостью, что необходимо для обеспечения полной пропитки образца исследуемого материала;

2) быть в полимерном состоянии не хрупкими, но достаточно твердыми, т. е. удобными для получения ультратонких срезов с залитого в него биологического образца;

3) не изменяться в объеме; при полимеризации;

4) быть химически инертными к биологическим объектам, а также к реактивам, применяемым для обработки образца. Обеспечить сохранность локализации компонентов реакции на месте взаимодействия реактива с веществами клеток и тканей;

5) хорошо смешиваться с водой или с веществами, применяемыми при обезвоживании (спиртом, ацетоном, эпоксипропаном и др.);

6) не снижать четкости электронно-оптического изображения объекта исследования;

7) быть устойчивым к бомбардировке электронами.

Для заливки биологических объектов в ПЭМ применяют 2 вида сред: водонерастворимые и водорастворимые. Водонерастворимые среды: аралдит, эпон, вестопал, бутилметакрилат, метилметакрилат, мараглас-кардолитовый компаунд, эпоксидно-диановые смолы, стирол. Водорастворимые заливочные среды: аквон, дуркупан, гликольметакрилат, оксипропилметакрилат, желатин.

После пропитывания и поляризации заливочных сред готовят блоки - заполимеризованную в капсулах заливочную среду с биологическим образцом.

Рис. 36. Заточенный в виде усеченной призмы блок.

Для резки блоков используют сколы стекла или алмазные ножи. Стеклянные ножи очень недолговечны, их используют только один раз, а алмазные ножи могут служить при правильном обращении в течение нескольких лет.

Рис. 37. Алмазные ножи с ванночкой.

Изготовление ультратонких и полутонких срезов осуществляется при помощи ультрамикротомов. Основные требования предъявляемые к процессу ультратомии:

1) правильное приготовление пирамидки;

2) надежное крепление ножа и пирамидки в держателях;

3) поддержание правильных взаимоотношений пирамидки и режущей кромки ножа (параллельность нижней грани пирамидки и режущей кромки ножа и т.д.);

4) соблюдение формы мениска жидкости.

В настоящее время все современные ультратомы имеют общие технические характеристики:

1) сверхтонкая механическая, пьезоэлектрическая или тепловая подача; 2) прецизионная ориентация образца;

3) наличие грубой подачи для подведения образца и получения полутонких срезов или микросрезов;

4) возможность контроля за скоростью резания;

5) удаление ножа при обратном ходе объекта;

6) возможность прецизионного освещения и наблюдения за процессом резания;

7) автоматическое приближение и удаление образца от ножа.

Чтобы получить качественные ультратонкие срезы необходимо руководствоваться следующими правилами:

1) режущий край ножа необходимо поддерживать высокого качества (проверяется при большом увеличении и хорошем освещении);

2) угол наклона - не более 3-4⁰;

3) скорость резания - оптимальная;

4) оптимальное пропитывание и полимеризация;

5) отсутствие посторонних вибраций;

6) площадь пирамидки свести к минимуму - не более 0.1 мм²;

7) лезвие ножа и поверхность пирамидки должны быть параллельны;

8) твердые блоки лучше резать алмазным ножом, мягкие — стеклянным;

9) верхняя и нижняя грань пирамидки выдерживаются строго параллельными.

Рис. 38. Современный ультрамикротом (фирма Leica), позволяет изготавливать ультратонкие срезы толщиной от 1нм до 2,5 мкм и полутонкие срезы от 2,5 мкм до 15 мкм.

Все большее применение получают методы приготовления, ультратонких срезов без фиксации и заливки клеток в твердые заливочные среды. Это методы криоультрамикротомии, т. е. получение срезов с замороженных тканей, моментально охлажденных до температуры жидкого азота (–196⁰С). При этом происходит практически одномоментное торможение всех метаболических процессов, а вода из жидкой фазы переходит в твердую, но не кристаллическую, ее молекулярная структура беспорядочна (стекловидное состояние). Такие твердые блоки при температуре жидкого азота можно резать на ультратонкие срезы (нож при этом также охлажден). Полученные срезы используют для выявления в них активности ферментов, для проведения иммунохимических реакций, для изучения ферментативного переваривания и т. п. Изучение срезов, полученных на криоультратомах, показало, что общая структура и композиция клеточных компонентов в данном случае мало отличаются от того, что видно при использовании химической фиксации и обычных приемов получения ультратонких срезов

После проведения ультрамикротомии блоков, полученные ультратонкие срезы монтируют на сетки или бленды для поддержания и дальнейшей работы.

Рис. 39. Опорная сетка, диаметр 3мм.

Срезы, смонтированные на сетках с подложкой, необходимо дополнительно химически контрастировать – «окрашивать», так как биологические структуры электронно-оптически прозрачны. За счет осаждения электронно-плотных веществ контрастированиеможет быть позитивным - усиление электронной плотности исследуемых структур по сравнению с фоном, окружающим объект (электронно-плотные вещества осаждаются на клеточных структурах) и негативным(увеличение электронной плотности фона контрастирующие вещества (вводятся в среду, окружающую исследуемые структуры). Контрастирование биологических объектов может быть осуществлено как до, так и после заливки в блоки, при этом ультратонкие срезы лучше всего контрастировать непосредственно перед просмотром в электронном микроскопе.

Для получения необходимого электронно-оптического контраста проводят импрегнацию объекта различными веществами, содержащими тяжелые атомы. К ним относятся, прежде всего, осмиевая кислота и перманганат калия, которые одновременно являются и фиксаторами. Кроме них дополнительно применяются молибденофосфорная кислота (фосфорно-молибденовая кислота), триводороддодекаволь-фрамофосфат (фосфорно-вольфрамовая кислота), соли урана (уранилацетат), соли свинца (цитрат свинца), нитрат таллия, карбогидразид, соли серебра и д.р.

Одним из широко распространенных методов контрастирования биологических объектов является оттенение металламис изготовлением реплик (слепок поверхности объекта). В этом случае в специальных вакуумных установках производится термическое испарение металла при вакууме 10^-4 Па. При этом атомы металла разлетаются от места испарения по прямым траекториям. Встречаясь с объектом, они осаждаются на нем в виде слоя; его толщина будет больше в местах, перпендикулярных направлению полета частиц металла. В участках, где объект экранирует пучок частиц, возникнут «тени». Таким образом, напыленная часть объекта обладает большей плотностью, чем напыленная подложка (фон), и поэтому объект будет виден. Минус этого метода в том, что он приводит к увеличению размеров объекта на толщину напыленного слоя, который в лучшем случае достигает 10 – 15 Ǻ. Другой недостаток его в том, что он дает информацию только о внешнем виде и объеме частиц.

Металлы и вещества, используемые для напыления, должны обладать следующими свойствами:

1) большой электронной плотностью;

2) небольшой величиной зерна;

3) отсутствием грануляции металла под воздействием электронного пучка;

4) химической стойкостью;

5) легкостью испарения.

Для контрастирования оттенением используется платина, палладий, их сплавы, углерод.

Метод реплик в ПЭМ имеет большее разрешение (2-3 нм), чем обычный метод СЭМ. В настоящее время существуют два метода изготовления реплик: при одноступенчатом методе исследуемый объект покрывают повторяющим рельеф поверхности слоем вещества, который после отделения образует реплику. При двухступенчатом методе с объекта первоначально делают так называемый промежуточный отпечаток, с которого затем снимают вторичную реплику. При изготовлении реплик одноступенчатым методом используют формвар или коллодий (если не требуется высокое разрешение) либо напыленные в вакууме слои углерода или кварца (если необходимо изготовить реплики с высоким разрешением). При двухступенчатой методике промежуточный отпечаток изготавливается в виде прочной пленки, легко выдерживающей механическое отрывание.

Реплику приготавливают следующим образом: на поверхность образца наносится тонкий слой 1%-ного раствора коллодия (целлоидина) в амилацетате. После высушивания поверхность покрывается еще несколькими слоями 2%-ного целлоидина. Пленку осторожно снимают и высушивают. Та поверхность пленки, которая соприкасалась с образцом, напыляется платиной (обычно под острым углом 45⁰) и углеродом (перпендикулярно поверхности под углом 90⁰). Пленку помещают на поверхность хлороформа напыленной стороной вверх для растворения целлоидина, затем реплику вылавливают и высушивают. Если реплики (коллодиевые или формваровые) используют без оттенения, то их разрешение и контрастность неудовлетворительны. В ряде случаев электронно-плотный материал (металл) напыляют непосредственно на исследуемый объект. Затем наносят слой углерода для образования углеродной пленки.

Во время напыления происходит агрегирование атомов металлов. Величина агрегатов зависит от природы атомов и поверхности подложки. Явление декорирования подложек представляет собой результат вторичного перераспределения атомов металла после их осаждения на напыляемой поверхности и зависит в основном от заряда поверхности. Атом, который осаждается на поверхности, становится центром нуклеации последующих. Если интенсивность напыления повышается, то число центров возрастает, покрытие становится более мелкогранулярным. Уменьшение расстояния между образцом и мишенью приводит к снижению гранулярности образующейся пленки, при этом происходит существенное нагревание образца.

Метод замораживания–травления заключается в том, что объект сначала быстро замораживают жидким азотом, а затем при той же температуре переносят в специальную вакуумную установку. Там замороженный объект механическим способом скалывается охлажденным ножом. При этом обнажаются внутренние зоны замороженных клеток. В вакууме часть воды, перешедшей в стекловидную форму, возгоняется («травление»), а поверхность скола последовательно покрывается тонким слоем испаренного углерода, а затем металла. Таким образом со скола замороженного и сохраняющего прижизненную структуру материала получают реплику. Затем уже в условиях комнатной температуры ткань или клетки растворяют в кислотах, но пленка-реплика при этом остается цела, ее изучают в электронном микроскопе. Этот метод имеет два преимущества: изучают реплики со сколов нативных образцов; исследуют рельеф поверхности мембран клетки, что недостижимо другими методами. Оказалось, что и в этом случае общая организация клетки и ее компонентов сходна с тем, что мы видим при химической фиксации или при криотомии. Этот метод позволил увидеть, что как на поверхности, так и в толщине клеточных мембран располагаются глобулы, что мембраны не однородны по своей структуре.

В последнее время начинают применять методы высоковольтной (сверхвысоковольтной) микроскопии. Сконструированы приборы с ускоряющим напряжением 1–3 млн.В. Это очень дорогие приборы, что сдерживает их широкое применение. Преимущество этого класса электронных микроскопов не в том, что на них можно получить более высокое разрешение (при более короткой длине волны электронов), а в том, что при высокой энергии электронов, которые меньше поглощаются объектом, можно просматривать образцы большой толщины (1 – 10 мкм). Дополнительное использование стереоскопической съемки позволяет получить информацию о трехмерной организации внутриклеточных структур с высоким их разрешением (около 0,5 нм). Этот метод перспективен и в другом отношении: если при сверхвысокой энергии электронов уменьшается их взаимодействие с объектом, то в принципе это можно использовать при изучении ультраструктуры живых объектов. Сейчас ведутся работы в этом направлении.

Дата добавления: 2014-11-29