Основные положения иммунодиагностики

Основные положения иммунодиагностики. Материал для исследования иммунного статуса. Правила проведения иммунологического обследования. Общепринятые методы оценки состояния иммунитета. Особенности иммунологических показателей у детей.

Достижения иммунологии последних десятилетий привлекают внимание не только узких специалистов, но также и врачей почти всех специальностей: терапевтов, хирургов, гинекологов, педиатров, окулистов, дерматологов и других. Выявление аутоиммунного компонента широкого круга заболеваний и распространенность вторичных иммунодефицитных состояний способствовали разработке различных иммунологических тестов для диагностики заболевания, выбора метода лечения, прогнозирования тяжести течения и понимания патогенеза симптомов данного заболевания.

В настоящее время лабораторные методы иммунодиагностики различных звеньев двух взаимосвязанных систем иммунитета – врожденной и адаптивной – применяются для оценки функционирования иммунной системы в норме и при заболеваниях человека. Эти методы составляют основу иммунодиагностики, целью которой являются, прежде всего:

· диагностика нарушений функций определенных звеньев иммунной системы, имеющих отношение к конкретному заболеванию у конкретного больного, а также

· выбор алгоритма индивидуальной иммунокоррекции и контроля ее эффективности.

В настоящее время с диагностическими целями чаще всего используют стандартный набор лабораторных тестов для определения иммунного статуса больных, хотя не все показатели иммунного статуса в конечном итоге могут иметь отношение к иммунодиагностике. Так как иммунный статус неоднороден, необходимо различать иммунный статус здорового организма и два его вида при патологии: антигенспецифический и антигеннеспецифический. Различают шесть вариантов антигенспецифического иммунного статуса: инфекционный, аллергический, аутоиммунный, онкологический, посттрансплантацонный, репродуктивный. Антигеннеспецифический формирует три варианта иммунного статуса: первичный и вторичный иммунодефицитные, лимфопролиферативный. Каждый вариант предусматривает оценку как общего, так и локального иммунного статуса. Такое деление важно, так как для каждого варианта иммунного статуса имеются свои, характерные иммунологические показатели.

Большинство методов оценки иммунного статуса имеют решающее значение лишь для выявления иммунодефицита, тогда как для диагностики других иммунопатологических состояний наиболее важно определение состояния антигенспецифической иммунологической реактивности: антител и эффекторных лимфоцитов. С учетом этого и в зависимости от конкретной необходимости и производится оценка иммунного статуса больного, т.е. поиск основного дефекта в системе иммунитета. Так как такой дефект может локализоваться в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета, то для оценки иммунного статуса, особенно иммунодефицитного, необходимы многие показатели, включая тесты первого и второго уровней. Кроме того, для иммунодиагностики могут быть использованы и неиммунологические методы исследования (общеклинические, биохимические и др.).

Иммунологические методы диагностики основаны на иммунных реакциях, на определении клеточного состава, рецепторного репертуара и функций иммунокомпетентных клеток, а также на определении качественного и количественного состава важнейших молекул иммунной системы (цитокинов, растворимых форм рецепторов, медиаторов, белков и ингибиторов комплемента, гормонов тимуса и др.).

Хотя к настоящему времени разработано много стандартизованных методов иммунодиагностики, она все еще находится в периоде становления. Современные методы иммунодиагностики являются достаточно дорогостоящими и трудоемкими, а значит, к назначению этих методов нужно подходить грамотно и с большой ответственностью. Соответственно возникает необходимость разработки определенных показаний для их назначения. В настоящее время выделено три группы показаний:

· заболевания или состояния, при которых иммунологические методы исследования имеют решающее значение (СПИД, первичные иммунодефициты, трансплантация);

· заболевания, при которых методы оценки иммунного статуса способствуют текущему контролю за лечением (антибиотикотерапия, примененение цитостатиков и иммунодепрессантов, лучевая терапия и др.), оценке степени их тяжести, прогнозу осложнений и исходов заболеваний (инфекционнные заболевания с затяжным или хроническим течением, оперативные вмешательства);

· болезни, при которых специальные иммунологические методы помогают в дифференциальной диагностике заболеваний (аутоиммунные заболевания, лейкозы, лимфомы и др.).

В настоящее время, как правило, применяется двухэтапный принцип оценки иммунного статуса человека. Его основные положения заложены в так называемой иммунограмме, отражающей, в основном, показатели тестов первого уровня, но, нередко, в зависимости от оснащенности лаборатории, и второго уровня.Иммунограмма представляет собойминимальный комплекс лабораторных показателей, достаточный для выявления иммунопатологического процесса в организме. При расшифровке конкретной иммунограммы показатели сравниваются с интервалом колебаний соответствующего показателя в норме. Эти интервалы определены в результате иммунологического исследования больших групп здоровых людей с использованием стандартизированных методов, приборов и реактивов.

В соответствии с двухэтапным принципом оценки иммунного статуса для иммунодиагностики используются лабораторно-диагностические тесты первого и второго уровней.

Первый – ориентировочный уровень включает простые, так называемые, ориентировочные тесты, позволяющие охарактеризовать функцию основных компонентов иммунной системы организма, выявить «грубые» дефекты в различных звеньях врожденного и адаптивного иммунитета. К тестам первого уровня относятся:

· определение общего числа лейкоцитов, лимфоцитов, нейтрофилов, моноцитов и тромбоцитов в периферической крови;

· определение относительного и абсолютного количества Т- и В-лимфоцитов, NK-клеток с использованием МКА против CD3, CD20, CD16/56-антигенов соответственно;

· определение количества субпопуляций Т-лимфоцитов: Т-хелперов (CD4⁺), ЦТЛ (CD3⁺CD8⁺) и их соотношения (CD4⁺/ CD8⁺);

· определение концентрации основных сывороточных иммуноглобулинов (Ig M, IgG, IgA);

· определение фагоцитарной активности лейкоцитов, НСТ-тест;

· определение уровня ЦИК в сыворотке и крови;

· тест торможения миграции лейкоцитов;

· другие показатели.

При наличии специальных показаний и отклонений в ориентирующих тестах на втором этапе проводится более тщательный анализ состояния отдельных звеньев иммунитета человека, позволяющий уточнить характер локализации дефекта, выявленного на предыдущем этапе, и решить вопрос о целесообразности применения иммунокоррекции.

Набор тестов второго уровня включает тесты, характеризующие состояние иммунной системы как in vivo (оценка эффективности иммунизации; результаты кожных проб), так и in vitro, и может быть различным в зависимости от поставленных задач.

Например, для оценки аутоиммунного статуса дополнительно проводят определение уровней специфических аутоантител; для оценки аллергического статуса – проведение кожных проб и т.д. С помощью аналитических тестов второго уровня определяют:

· количество субпопуляций лимфоцитов: Тх1, Тх2, Тх17, естественные и индуцированные регуляторные Т-клетки, NKT-лимфоциты и др;

· пролиферативный ответ на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформа-

ции лимфоцитов);

· цитотоксическую активность киллерных лимфоцитов (CD8⁺ЦТЛ, NK-клеток и др.);

· функциональную активность Тх1, Тх2, Тх17, естественных регуляторных Т-клеток по внутриклеточному содержанию и продукции типичных цитокинов (IFN-γ, ИЛ-4, ИЛ-17, TGF-β соответственно);

· содержание наиболее типичных цитокинов в сыворотке и биологических жидкостях;

· экспрессию рецепторов цитокинов (CD25 – рецептор к ИЛ-2);

· экспрессию активационных маркеров: CD69, CD71, HLA-DR и др.;

· классы и подклассы сывороточных, секреторных и других иммуноглобулинов;

· антитела разной специфичности, в том числе аутоантитела, патологические иммуноглобулины;

· оценка фагоцитарного звена;

· экспрессию на лейкоцитах молекул адгезии;

· содержание различных компонентов комплемента;

· другие показатели.

Для оценки состояния врожденной фагоцитарной системы чаще всего используется определение:

· фагоцитарного индекса нейтрофилов и моноцитов;

· бактерицидности нейтрофилов и моноцитов;

· образования активных форм кислорода и азота;

· хемотаксиса;

· экспрессии на лейкоцитах молекул адгезии.

Для оценки состояния адаптивногогуморального иммунитета используют определение:

· основных классов и подклассов иммуноглобулинов IgA (1,2), Ig M, IgG (G1-4) и IgE в сыворотке крови, а также в секретах слизистых;

· общей гемолитической активности комплемента;

· концентрации циркулирующих иммунных комплексов.

Для определения клеточного состава лимфоидной популяции используется иммунофенотипирование лимфоцитов с помощью моноклональных антител, позволяющее определять процентное содержание лимфоцитов и их субпопуляций, а также наличие на них рецепторов к некоторым цитокинам, например:

· CD2⁺(CD3⁺), CD4⁺, CD8⁺ – Т-лимфоциты и их субпопуляции;

· CD20⁺ (19⁺, 21⁺, 22⁺, 72⁺) – В-лимфоциты;

· CD16⁺CD56⁺ – NK-клетки;

· CD25⁺ - рецептор для ИЛ-2.

Для определения функциональной активности лимфоцитов используются, например, следующие тесты:

· оценка цитотоксической активности NK - клеток;

· исследование пролиферативного ответа на Т- и В-митогены (реакция бласттрансформации лимфоцитов).

Для определения цитокинового статуса используются тесты:

· определение количества цитокинов в биологических жидкостях;

· определение спонтанного и индуцированного синтеза цитокинов мононуклеарами периферической крови in vitro;

· определение внутриклеточного содержания цитокинов, в частности, IFN-g и IL-4 как маркеров Th1 и Th2-лимфоцитов.

Еще в 1990 году Л.В.Ковальчуком и А.Н.Чередеевым был предложен патогенетический принцип оценки функциональной активности иммунной системы, который основан на выявлении уровня патогенетического дефекта в результате лабораторных исследований ключевых этапов иммунного ответа: распознавания, активации, пролиферации, дифференцировки, эффекторной фазы иммунного ответа и регуляции на всех этапах иммунного ответа. Один из важнейших постулатов этой концепции: при блоке предыдущего этапа последующий несостоятелен, и нужно искать подходы для снятия данного блока. Примерный современный набор тестов, который целесообразно применять с этой целью, приведен в табл 22.

Таблица 22. Примерные тесты для оценки ключевых этапов иммунного ответа

Стадии развития иммунного ответа	Примеры тестов, применяемых для оценки соответствующей стадии иммунного ответа
Распознавание	СКЛ, определение экспрессии молекул HLA II класса
Активация	Определение на клетках маркеров активации CD25, CD69, CD71, HLA-DR и др., определение уровня провоспалительных цитокинов, определение внутри-клеточных сигнальных молекул
Пролиферация	РБТЛ с митогенами, РБТЛ на специфические анти-гены и аллергены
Эффекторная стадия	Исследование клеточной цитотоксичности (CD8^+ЦТЛ, NK-клеток и др.); определение концентрации сывороточных и секреторных иммуноглобулинов
Регуляция иммунного ответа	CD4^+/CD8^+, соотношение про- и противовоспали-тельных цитокинов в сыворотке и различных биоло-гических жидкостях, определение количества CD4^+CD25^+FохР3^+-клеток

Материал для исследования иммунного статуса

Современная практика клинико-иммунологических исследований среди различных биологических жидкостей выделила основным объектом анализа кровь – ее клеточные компоненты и сыворотку. Для иммунологических исследований используют клетки врожденного и адаптивного иммунитета – лейкоциты, к которым относятся гранулоциты, моноциты и лимфоциты. Наибольший интерес с точки зрения иммунологов представляют лимфоциты – высокоспециализированные клетки адаптивной иммунной системы. Выделение мононуклеарной фракции крови, в том числе лимфоцитов, производят по методу Boyum (1968), основанному на различии плотности форменных элементов крови.

Для исследования сыворотки кровь берется обычно из локтевой вены, в пробирке она быстро свертывается и разделяется на сгусток с попавшими клетками крови и прозрачную сыворотку крови, которую можно использовать для определения растворимых компонентов врожденного и адаптивного иммунитета.

При необходимости получения клеточных компонентов крови для иммунологических исследований в пробирку для забора крови предварительно добавляют гепарин – антикоагулянт, который препятствует свертыванию крови и обеспечивает сохранение форменных элементов крови в виде суспензии в плазме. Затем кровь разводят физиологическим раствором и наслаивают ее в пробирку, наполовину заполненную фиколл-изопаком или фиколл-верографином, и затем центрифугируют. Смесь полисахарида фиколла и рентгеноконтрастного вещества изопак или верографина создает градиент с такой плотностью, которая позволяет при центрифугировании суспензии разделить клетки периферической крови на фракции с большей и меньшей, чем градиент, плотностью. В градиенте плотности фиколл-изопака или фиколл-верографина (d=1,077г/см³) на границе раздела фаз образуется кольцо, содержащее слой мононуклеарных клеток (лимфоциты и моноциты). Эритроциты и гранулоциты оседают на дно пробирки (рис.51). Это объясняется тем, что плотность фиколл-верографина выше, чем плотность лимфоцитов, но ниже, чем плотность эритроцитов и гранулоцитов.

Материалы для исследования показателей иммунной системы могут быть различными в зависимости от клинической картины заболевания и от

Рисунок 51. Выделение лимфоцитов в градиенте плотности

Дата добавления: 2014-11-29