Экспериментальная часть. Дополнительная литература

Дополнительная литература

12.2.1. Скулачев В. П. Энергетика биологических мембран. – М.: Наука, 1989. – 564 с.

12.2.2. Кулаев И. С. Неорганические полифосфаты и их роль на разных этапах клеточной эволюции. //Соросовский образовательный журнал, 1996. – № 2. – С. 28 – 35.

12.2.3. Кулинский В. И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред и защита. //Соросовский образовательный журнал, 1999. – №1. – С. 2 – 7.

12.2.4. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма. – М.: Мир, 1977. – 405 с.

12.2.5. Хочачка П., Сомеро Дж. Биохимическая адаптация. – М.: Мир, 1988. – 566 с.

12.2.6. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. – М.: Мир, 1982. – 310 с.

12.2.7. Брухман Э. Э. Прикладная биохимия. – М.: Легкая и пищевая промышленность, 1981. – 296 с.

12.2.8. de Cruif P. Охотники за микробами. – Молодая гвардия, 1957. – 488 с.

Как уже сказано, спиртовое брожение – простая и удобная модель для освоения основных приемов изучения метаболизма. Мерой его активности служит динамика изменений концентрации Фн в среде брожения за определенные отрезки времени.

12.3.1. Подготовка, инкубация и контроль системы брожения

1. Студенты-добровольцы или дежурные, по указанию лаборанта занимают рабочее место с необходимой посудой, растворами и готовыми навесками дрожжей и глюкозы по 1,5 г.

2. Один из студентов маркирует 4 центрифужных пробирки и, разлив в них по 1 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты = ТXУ, помещает пробирки в ледяную баню.

3. Параллельно, другой студент смешивает в фарфоровой ступке навески дрожжей и глюкозы и, по возможности, растирает их пестиком, постепенно добавляя к смеси 20 мл дистиллята, порциями по 2-5 мл.

4. Количественно перенести смесь в коническую колбу на 100 мл, омыв ступку и пестик 10 мл 0,01 М фосфатного буфера рН 7,4.

5. Перемешав содержимое колбы, тут же отобрать из нее для контроля 1 мл взвеси и, для осаждения белков, перенести его в стоящую во льду пробирку № 1.

6. Поместить колбу с системой брожения в термостат при 37 С и установить таймер на 15 мин.

7. Каждые 15 мин по звонку таймера, дежурные отбирают из колбы пробы по 1мл, соответственно помещая их в стоящие на льду пробирки № 2, 3 и 4.

8. Соответственно пробиркам, пронумеровать 4 мерных колбы на 25 мл для последующих разведений центрифугата.

9. По окончании инкубации, с термостатом, системой брожения и оборудованием рабочего места поступить по указанию лаборанта.

10. Через 10 мин после осаждения белков в пробе 4, пробирки извлечь из ледяной бани и, в соответствии с работой 6.3.1, попарно уравновесить их на центрифужных весах, после чего разместить по диаметру ротора центрифуги.

11. Убедившись, что все студенты выполнили п. 10, закрыть центрифугу крышкой и, соблюдая правила работы с нею (п. 1.1.20), включить центрифугу при 2000 об/мин на 10 мин.

12. Учитывая высокую чувствительность фосфомолибдатного метода анализа и пределы его калибровочного графика (см. п. 12.3.2.), развести надосадки в 50 раз. Для этого:

13. Меняя наконечники полуавтоматического дозатора на 500 мкл, перенести по 0,5 мл каждого надосадка в соответственно пронумерованные мерные колбы.

14. Довести водой до меток объемы их содержимого.

12.3.2. Количественноеопределение ортофосфата

методом Лоури-Лопеца

Принцип метода: Основан на образовании фосфомолибдатного комплекса (Н₇[Р(Мо₂О₇)₆] х nН₂О), который восстанавливают гидрохиноном и др. до молибденовой сини, колориметрируя затем интенсивность окраски. Белки, мешающие определению Фн, предварительно удаляют из проб общепринятыми способами. Один из самых простых и чувствительных (35-50 нмоль Фн на пробу) – метод Лоури-Лопеца, где восстановитель – аскорбиновая кислота.

Ход работы: 1. За время инкубации системы брожения, каждая рабочая пара студентов маркирует 10 пробирок: 6 – для построения калибровочных проб и еще 4 – для разведенных центрифугатов.

2. В соответствии с таблицей 12.2, в пробирки 1-6 внести указанные объемы основного 10^{-4 М раствора} Na₂HPO₄ х 2H₂O и дистиллята.

Таблица 12.2

Калибровка растворов для определения неорганического фосфата = Фн

3. Получив у дежурных мерные колбы 1 – 4 с разведенными центрифугатами исследуемых проб, отобрать из каждой по 2,7 мл раствора и, соответственно перенести их в пробирки 7 – 10.

4. Получить у лаборанта свежеприготовленные 1 % растворы:

а) молибдата аммония (NH₄)Mo₇O₂₄ х 4Н₂О в 6 н серной кислоте; б) аскорбиновой кислоты в 0,0005 н растворе сульфата меди (CuSO₄ х 5H₂O).

5. Во все 10 рабочих пробирок добавить по 0,4 мл 1 % раствора молибдата аммония.

6. Точно через 5 мин, также во все пробирки добавить по 0,4 мл 1% раствора аскорбата и, тщательно перемешав пробы, оставить их точно на 20 мин на столе для развития окраски.

7. В соответствии с работой 4.3.1, прогреть ФЭК КФК-2.

8. Фотометрировать все 10 проб против воды, в кюветах на 5 мм и красном светофильтре, занося соответственно, результаты калибровки в таблицу 12.2, а исследуемых проб – в таблицу 12.3 протокола занятия.

9. По аналогии с работой 7.3, на основании данных таблицы 12.3 построить калибровочный график зависимости А = абсорбции раствора от концентрации Фн в пробах.

10. С помощью калибровочного графика и, с учетом разведения проб в 50 раз, рассчитать и внести в таблицу 12.3. концентрации Фн в инкубационной среде.

Таблица 12.3

Динамика убыли ортофосфата в инкубационной среде

в процессе брожения

11. По результатам опыта, построить график динамики убыли фосфата в процессе брожения и сделать выводы.

Дата добавления: 2014-12-27