Экспериментальная часть. Дополнительная литература

Дополнительная литература

14.2.1. Березин И. В., Савин Ю.В. Основы биохимии. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – С. 166 – 210.

14.2.2. Биохимия. Учебник для ВУЗов под ред. Е. С. Северина. – М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С. 417 – 432.

14.2.3. Кейтс М. Техника липидологии. – М.: Мир, 1975. – 430 с.

14.2.4.Бергельсон Л., Дятловицкая Э. В., Молотковский Ю. Г. и др. Препаративная биохимия липидов. – М.: Наука, 1981. – 260 с.

14.2.5. Липосомы в биологических системах. Под ред. Г. Грегориадиса и А. Аллисона. – М.: Медицина, 1983. – 384 с.

14.2.6. Введение в биомембранологию. Под ред. А. А. Болдырева. – М.: Изд-во МГУ, 1990. – 208 с.

Уже сказано, что преобладание углеводородных групп в веществах класса липидов сильно ограничивает их растворимость в воде и разнообразие, характерных для них качественных реакций. Поэтому работу с липидами проводят под тягой, извлекая их из образцов экстракцией, с помощью органических растворителей и их смесей: гексана, метиленхлорида, хлороформа, метанола и др. Посуда для работы с ними, должна быть не только чистой, но градуированной, оснащенной притертыми пробками и абсолютно сухой.

В курсе органической химии изучались реакции выявления карбоксильных групп и двойных связей ВЖК, соответственно с помощью титрования щелочами и галогенпроизводными. Наличие и количество фосфатных групп в фосфо- и сфинголипидах, устанавливают по реакции с молибденовокислым аммонием (см. Занятие 12). Поэтому рассмотрим подробней, лишь работу со стеролами, распространенными у всех эукариот. Как и другие липиды, стеролы, не растворимы в воде, но взаимодействуют с нею (1:100 молекул), образуя стойкие непрозрачные эмульсии.

14.3.1. Качественные реакции со стеролами выполняют в вытяжном шкафу, соблюдая правила работы с органикой и концентрированными кислотами.

1) Принцип пробы Сальковского. Под действием концентрированной серной кислоты, ХС дегидратируется в холестерилен, имеющий красную окраску. Его дальнейшая конденсация в бихолестандиен вызывает флуоресценцию в зелёной области спектра, позволяя обнаружить микроколичества (10^-7 – 10^-9 М/л), например стероидных гормонов в биожидкостях.

Ход работы: 1. Внести в чистую сухую пробирку 0,1-0,2 мл хлороформного экстракта мозга крыс.

2.Осторожно по каплям, добавить такой же объем концентрированной серной кислоты. Перемешать и зарегистрировать окраску.

2) Принцип реакции Либермана – Бурхарда – тот же, что и у предыдущей. Однако, в присутствии уксусного ангидрида, бихолестандиен образует сульфопроизводное зеленого цвета. Эта реакция менее чувствительна (10^-4 – 10^-6 М/л) и применяется для колориметрических методов определения ХС.

Ход работы: 1. В пробирку с 0,1-0,2 мл хлороформного экстракта мозга крыс добавить 3-5 капель уксусного ангидрида и 2-3 капли концентрированной серной кислоты. Содержимое перемешать и через 5 мин, зарегистрировать развитие окраски.

3) Принцип качественной реакции Петтенкофера на желчные кислоты: В присутствии концентрированной серной кислоты, из фруктозы и ее производных возникает гидроксиметилфурфурол, дающий с желчными кислотами пурпурную окраску.

Ход работы: 1. На дно сухой чашки Петри или часового, но не предметного стекла, нанести одну каплю желчи и каплю 20 % раствора сахарозы.

2. Хорошо перемешать их стеклянной палочкой.

3. Не сдвигая с места чашки/стекла, нанести рядом 3 капли концентрированной серной кислоты.

4. Наблюдать через 1-3 мин., в месте контакта капель, развитие красной окраски, при стоянии переходящей в красно-фиолетовую.

14.3.2. Метод определения общего холестерола в биожидкостях, с помощью тест-набора реагентов «Новохол» (ЗАО «Вектор-Бест»)

Меры предосторожности: При работе с кровью людей, считать ее потенциально инфицированной, а потому быть не только в халате, но, желательно, и в одноразовых перчатках.

Реактивы:

1. Калибровочный раствор холестерола - 4,65 ммоль/л

2. Рабочий раствор – смесь лиофильно высушенных Е и реагентов в 0,01 м растворе фосфатного буфера.

Принцип метода (см. схему на рис. 14.6):

Рис. 14.6. Схема последовательности ферментных реакций метода

Ход работы: 1. В соответствии с таблицей разлить в 2 пробирки:

* - В связи с необходимостью экономии калибровочного раствора холестерола, пробу 2 (калибратор) на группу студентов, выполняет лишь одна рабочая пара.

2. Содержимое пробирок тщательно перемешать и выдержать 10 мин в термостате при 37 С.

3. Против рабочего раствора, в кювете толщиной 10 мм со вкладышем, фотометрировать при λ 490 нм – зеленом светофильтре абсорбцию опытной и калибровочной проб.

Расчет концентрации холестерола в пробе вести по формуле:

С – концентрация холестерола;

Ао – абсорбция исследуемой пробы;

Ак – абсорбция калибровочной пробы.

Нормальная концентрация холестерола в сыворотке крови – не более 5,2 ммоль/л.

Дата добавления: 2014-12-27