Углеводный обмен 2 страница

При изучении метаболизма лимфоцитов у больных инфекционно-аллергическими миокардитами отмечено отчетливое повышение (в 2 раза) активности кислой фосфатазы (КФ) в лимфоцитах, при этом повышение КФ могло сочетаться как с нормальным уровнем сукцинатдегидрогеназы, так и с ее снижением. Последнее сочетание рассматривается как показатель наличия аллергических реакций замедленного типа.

Неудовлетворенность клиницистов имеющимися в их арсенале методами диагностики (в частности лабораторными) побуждает к дальнейшему поиску более информативных подходов. Установлена важная роль в патогенезе миокардита нарушений калликреин-кининовой системы, что коррелирует с тяжестью течения болезни. Наиболее тяжелому течению миокардита соответствует более выраженное усиление активности кининогенеза, резкое повышение адсорбции калликреина на каолине, резкое снижение активности ингибиторов калликреина. При более легком течении эти сдвиги были выражены в меньшей степени. Отмечается также, что при рецидивах миокардита одновременно наблюдались сдвиги калликреин-кининовой системы, мало выраженные в период ремиссии болезни.

В диагностике миокардита может помочь исследование некоторых иммунных реакций, непосредственно связанных с поражением миокардиальных волокон. Так, можно выявить увеличение титра противомиокардиальных антител, а также клеточные реакции (торможение миграции лейкоцитов при постановке реакции с антигенами миокарда и миокардиальных мембран). Реакция торможения миграции лейкоцитовуказывает на наличие сенсибилизации лейкоцитов к данному антигену. В норме индекс миграции составляет 0,8-1,0. Снижение индекса миграции ниже 0,8 расценивается как положительный результат. Наличие аутоиммунных сдвигов существенно помогает в диагностике миокардитов, в патогенезе которых иммунный механизм играет ведущую роль. Обнаружение этих реакций, в особенности в сочетании с гиперферментемией существенно помогает в дифференциации миокардита тяжелого течения и дилатационной кардиомиопатии. Последнее заболевание в настоящее время рассматривается как исход бывшего ранее миокардита.

Анализ клинической ситуации. Учебная задача 2.

Больная Каримова Л.Е., 18 лет. Поступила в клинику с жалобами на боли в коленных, локтевых и межфаланговых суставах кистей, чувство «скованности» в них, боли под лопатками при глубоком дыхании, чувство нехватки воздуха, колющие боли в области сердца при перемене погоды, общую слабость, повышение температуры тела до субфебрильных цифр.

Заболела остро 4 месяцев назад, когда появилась резкие боли в левом локтевом и лучезапястном суставах, чувство «скованности» в них, боли в пояснице, преимущественно по ночам, слабость в руках и ногах, лихорадка до 38˚С. Вскоре появились эритематозные высыпания на щеках и спинке носа, гиперемия кончиков пальцев рук. Лечилась в местной больнице, где предполагали ревматизм в активной фазе, ревмокардит, полиартрит, поражение почек. В анализах крови была выявлена анемия (Hb 80-100г/л), тенденция к лейкопении, увеличение СОЭ до 33мм/ч. На фоне лечения пенициллином, индометацином, дексаметазоном, антигистаминными препаратами температура снизилась до субфебрильных цифр. Однако сохранились артралгии, распространившиеся на коленные и межфаланговые суставы кистей, стали возникать колющие боли в области сердца, чувство нехватки воздуха. В течение последнего месяца появились боли под лопатками при глубоком дыхании.

При поступлении в клинику отмечалась лихорадка до 38,3˚С, резкая бледность кожных покровов, капилляриты ладоней, лимфаденопатия, увеличение в объеме и гипертермия правого коленного сустава. В легких - дыхание везикулярное, хрипы не выслушивались. Перкуторно - границы сердца не расширены. Тоны сердца приглушены, выслушивается трехчленный ритм, систолический шум на верхушке. Пульс 90 в мин, ритмичный. АД-120/70мм рт.ст. Умеренная гепато- и спленомегалия. Почки не пальпировались.

Таким образом, у больной имелось поражение суставов (артралгии, артрит коленного сустава), сердца (одышка, тахикардия, «ритм галопа»), ретикулоэндотелиальной системы (лимфаденопатия, гепато- и спленомегалия), общевоспалительный синдром (лихорадка, бледность, общая слабость). Очевидно, заболевание относилось к группе ревматических болезней. Можно было предположить дебют ревматоидного артрита, системной красной волчанки, атаку ревматизма. Отсутствие четкой связи начала болезни со стрептококковой инфекцией, неэффективность лечения антибиотиками и нестероидными противовоспалительными средствами в анамнезе делали маловероятным последнее предположение. Учитывая полиорганность поражения (кожа, суставы, сердце, органы РЭС, почки), более вероятным представлялся дебют СКВ, чем ревматоидного артрита (РА). Наличие же тяжелого системного варианта РА с таким обширным поражением внутренних органов предполагало бы значительно большую выраженность суставного синдрома, чем у нашей пациентки.

Для подтверждения диагностической концепции было проведено подробное лабораторно-инструментальное обследование.

Рентгенография органов грудной клетки: усиление легочного рисунка за счет интерстициального компонента, уплотнение главной и добавочной междолевой плевры. Сердце и крупные сосуды - без видимых изменений.

Общеклинический анализ крови:

Эритроциты - 2,0х10¹²/л

Гемоглобин - 52г/л

Цветовой показатель - 0,78

Лейкоциты - 2,9х10⁹/л

П/я нейтрофилы - 6%

С/я нейтрофилы -50%

Лимфоциты - 32,0%

Моноциты - 5%

Эозинофилы 6%

Базофилы - 1%

Резко выраженный анизоцитоз, гипохромия эритроцитов, много мишеневидных эритроцитов, базофильная пунктуация эритроцитов

Тромбоциты - 329х10⁹/л

СОЭ - 65мм/ч

Биохимический анализ крови:

Общий белок - 74г/л

Альбумины - 32г/л

Холестерин - 2,8ммоль/л

Глюкоза - 6,1ммоль/л

Билирубин общий - 8,0мкмоль/л

Прямой (связанный) - 4,0мкмоль/л(50% от общего билирубина)

Сыв.железо - 20,5 мкмоль/л

ОЖСС - 20,5 мкмоль/л

% насыщения трансферрина железом – 50,4%

Иммуноглобулины классов

А – 2,2 МЕ/мл

М – 2,0 МЕ/мл

G – 17,0 МЕ/мл

Титр антигиалуронидазы – ниже 250ед.

СРБ – отр.

Анализ мочи: Анализ мочи по Нечипоренко:

Уд.вес - 1010 Лейкоциты – до 5000, эритроциты - до 1000

Реакция - кислая Цилиндры – гиалиновые, единичные в препарате

Белок - 2,50г/л

Сахар – полож.

Лейкоциты 4-6в п/зр

Эритроциты – 4-5 в п/зр

Цилиндры:

гиалиновые - 3-4 в п/зр

зернистые - 1-2 в п/зр

жирноперерожд. – до 5 в преп.

Суточная протеинурия – 4,2г

При электрофорезе белков сыворотки крови отмечалась гипергаммаглобулинемия до 51%.

В результате лабораторных исследований у больной выявлены гипохромная анемия, лейкопения, увеличение СОЭ, гипергаммаглобулинемия, LE-клеточный феномен, а также изменения в анализах мочи, характерные для нефрита (протеинурия, эритроцитурия, цилиндрурия). Суточная потеря белка составляла более 4,0г.

УЗИ: патологических изменений со стороны сердца не выявлено. Печень и селезенка несколько увеличены, паренхима их нормальной эхогенности. Почки не изменены.

Таким образом, у молодой девушки имелись полиартралгии и артрит коленного сустава, высыпания в виде «бабочки» в анамнезе и капилляриты ладоней, серозит (плеврит), поражение сердца (миокардит), почек (нефрит с признаками интерстициального поражения), гематологические нарушения (анемия, лейкопения), выявлены антинуклеарные антитела и LE-клетки, что позволило отвергнуть предположение о ревматизме и РА и поставить диагноз красной системной волчанки. Выявление признаков поражения почек в первые месяцы заболевания свидетельствовало об остром течении болезни.

Учитывая наличие резко выраженной гипохромной анемии при нормальном содержании железа в сыворотке, признаки выраженного гемолиза неиммунного характера (отрицательная реакция Кумбса), изменения морфологии эритроцитов, было высказано предположение о наличии гетерозиготной бета-талассемии, что подтверждено при исследовании малых фракций гемоглобина (выявление повышенного содержания фракции Hb А-2 и фетального Hb). Таким образом, анемия у больной имела двойное происхождение (СКВ в сочетании с бета-талассемией).

Больной была начата терапия преднизолоном в суточной дозе 60мг и азатиоприном в суточной дозе 100мг, на фоне которой отмечена четкая положительная динамика клинических и лабораторных показателей.

Красная системная волчанка - хроническое полисиндромное заболевание преимущественно молодых женщин и девушек; развивающееся на фоне генетически обусловленного несовершенства иммунорегуляторных процессов, приводящего к неконтролируемой продукции антител к собственным клеткам и их компонентам, с развитием аутоиммунного хронического воспаления.

Этиология СКВ неясна, хотя в настоящее время имеются данные о возможной роли хронической вирусной инфекции и мультифакториальной предрасположенности, связанной с полом, возрастом, генетически детерминированным нарушением иммунитета. При СКВ встречаются антигены HLA А11, В7, В35, DR2 и DR3. Для СКВ характерна выработка антинуклеарных антител, особенно антител к нативной (двуспиральной) ДНК. Значительную роль играет образование иммунных комплексов.

При СКВ комплексы антиген-антитело обнаружены в клубочках почки, базальной мембране кожи, в хориоидальном сплетении мозга и др. органах. Установлена прямая корреляция между уровнем ЦИК и обратная корреляция между уровнем комплемента и активностью болезни.

В зависимости от скорости развития полисиндромности и вовлечения почек выделяют острое, подострое и хроническое течение СКВ. При остром течении в ближайшие 3-6 месяцев отмечается выраженная полисиндромность, развитие нефрита или поражение ЦНС. При подостром течении развернутая клиническая картина наблюдается через 2-3 года от начала болезни. При хроническом течении длительное время отмечается рецидивирование тех или иных синдромов (полиартрита, полисерозита, синдрома Рейно, дискоидной волчанки и др.), редко развивается поражение почек, практически никогда не наблюдается нефротический синдром.

Критерии диагноза СКВ:

1. Эритемия в виде «бабочки».

2. Дискоидные высыпания.

3. Фотосенсибилизация.

4. Язвы полости рта.

5. Артрит (неэррозивный, но может быть хроническим деформирующим, сходным с РА).

6. Серозит: плеврит, перикардит.

7. Поражение почек: стойкая протеинурия более 0,5г/сут.

8. Неврологические нарушения: судороги, психоз.

9. Гематологические нарушения: гемолитическая анемия, лейкопения или лимфопения.

10. Иммунные нарушения: наличие LE-клеточного феномена, антитела к ДНК и нативной ДНК в повышенном титре, антитела к Sm-ядерному антигену, ложноположительная реакция Вассермана.

11. Антинуклеарные антитела.

У нашей пациентки имелось 7 критериев, а именно: эритема в виде «бабочки» в анамнезе, артрит, серозит (плеврит), поражение почек (нефрит), гематологические нарушения в виде анемии и лейкопении, иммунные нарушения в виде LE-клеточного феномена и антинуклеарные антитела.

ГЛАВА 8. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Успехи молекулярной и клеточной биологии привели к возникновению молекулярной клинической диагностики. Эти исследования используются для лабораторной диагностики инфекций и многих пато­логических состояний человека путем детекции генных вариантов, присущих тому или иному виду организмов.

Молекулярную клиническую диагностику определяют в настоящее время как науку, занимающуюся выявлением патологий, изучением их причин и механизмов развития на молекулярном уровне. Преимущество такого подхода заключается в том, что он дает возможность выявить склонность к тому или иному заболеванию задолго до его клинических проявлений, вовремя принять профилактические меры, предотвратив его развитие или облегчив течение, и с учетом индивиду­альных особенностей применять терапию.

Используемые в лабораторных исследованиях современные молекулярные технологии представлены в таблице 8.1.

Таблица 8.1. Основные методы современных молекулярно-диагностических исследований

(Долгов В.В., Меньшиков В.В., 2012)

Тип технологии	Методы
Молекулярно-генетические методы для поиска новых генов или аллелей. Выявление мутаций	Секвенирование. Анализ конформационного полиморфизма одноцепочечной ДНК (SSCP). Гетеродуплексный анализ. Денатурирующий гель-электрофорез. Химическое/ферментативное расщепление некомплементар-ных оснований. Масс-спектрометрия. ДНК-чипы V
Молекулярно-генетические методы для выявления извест­ных генов или аллелей	Аллельспецифическая гибридизация/амплификация (ПЦР, LCR, NASBA). Капиллярный денатурирующий гель-электрофорез. Мини-секвенирование в твердой фазе. Олигонуклеотидлигазный анализ (0LA)
Геномные функциональ­ные методы для опреде­ления генной активности (экспр-есссия генов)	Экспрессионные РНК-чипы. Количественный РТ-ПЦР
Протеомные технологии	Двухмерный электрофорез. Многомерная хроматография. Масс-спектрометрия. Белковые чипы (SELDI). Мультиплексный анализ по технологии «Люминекс» («Биоплекс»)

Молекулярно-генетические исследования позволяют проводить:

§ проводить диагностику инфекционных заболеваний по наличию или относительному содержанию специфических последовательностей ДНК/РНК патогенных микроорганизмов в биологических образцах;

§ осуществлять дифференциальную генную диагностику злокачественных новообразований с неопухолевыми (предопухолевыми) поражениями, определять прогностически неблагоприятные генотипы лейкозов, выявлять минимальную остаточную болезнь и рецидивы злокачественных заболева­ний;

§ осуществлять своевременную диагностику генных мутаций и генных вариан­тов у больных и их родственников в целях медико-генетического консульти­рования, а также для идентификации личности и установления родства.

Генную диагностику используют при решении задач скрининга (профилактиче­ском обследовании), для установления (уточнения) диагноза, ранней диагностики заболеваний. На основе генной диагностики проводят:

§ установление ориентировочного диагноза для выработки дальнейшей такти­ки обследования;

§ обоснование и планирование специфической терапии;

§ установление диагноза, включая исследование интраоперационного мате­риала (например, генотипирование Н. pylori в образцах слизистой оболочки желудка);

§ раннюю диагностику заболеваний (в некоторых ситуациях - единственный возможный метод диагностики на начальном этапе болезни, в частности при ранней диагностике гепатита С). Это эффективный метод уточняющей диагностики, а во многих случаях - основной диагностический метод (например, в выявлении наследственных забо­леваний и прогнозе развития лейкозов).

В основе всех молекулярно-биологических методов лежит представление о том, что универсальным носителем генетической информации, исключая РНК-вирусы, является ДНК. ДНК представляет собой двойную цепь, скрученную в спираль. Каждая цепочка состоит из соединенных последовательно нуклеотидов (рис. 3-28). Нити ДНК имеют противоположную направленность: 5'-концу одной нити соответствует 3'-конец второй нитки. Уникальным свойством ДНК является ее способность удваиваться. В живой клетке этот процесс развивается следующим образом: с помощью специальных ферментов – гираз происходит расплетание спирали в том ее участке, где должна наблюдаться репликация. При этом водородные связи между азотистыми основаниями разрываются и нити расходятся. Одна из цепей (смысловая) используется в качестве основной матрицы. Построение новой нити ДНК идет только в одном направлении — от 5'-конца к 3'-концу. Данный процесс осуществляется по принципу комплементарности. Это строгое соответствие соеди­нения азотистых оснований, занимающих положение в двух цепях ДНК напротив друг друга и соединенных водородными связями, в котором: аденин соединяется с тимином (А-Т) и гуанин соединяется с цитозином (Г-Ц).

В настоящее время полимеразная цепная реакция (ПЦР) является наиболее распространенной и приемлемой в лабораторной медицине молекулярно-генетической методикой. ПЦР признается «золотым» стандартом для диагностики инфекционных возбудителей различной природы. Вследствие уникальной специфичности и чувствительности метода появилась возможность обнаруживать единичные молекулы ДНК возбудителей в исследуемом биоматериале.

Метод основан на обнаружении в исследуемом материале специфичных фрагментов ДНК (РНК) различных биологических объектов, их избирательном синтезе и дальнейшей детекции про­дуктов реакции амплификации - ампликонов. Для ПЦР характер­ны такие уникальные свойства, как высокая специфичность, чув­ствительность, универсальность и малое время для исследования.

Метод ПЦР позволяет специфично увеличивать (амплифицировать) количество исследуемого образца ДНК в десятки и сотни раз. Непосредственное определение специфического участка ДНК имеет ряд преимуществ по сравнению с традиционными методами диагностики.

Идея ПЦР основана на том. что фрагмент гена можно размно­жить в пробирке, увеличивая количество его копий в миллионы раз. Механизм ПЦР заключается в синтезе invitroкоротких нуклеотидных последовательностей для их анализа. Для проведения ПЦР нужны пара олигонуклеотидов (праймеров), комплементар­ных исследуемому фрагменту, и фермент ДНК-полимераза. В определенных условиях праймеры способны распознавать гомо­логичные последовательности в денатурированной ДНК, связы­ваться с ними и служить затравкой для ферментативного синтеза копий участка изучаемого гена. Каждый цикл синтеза удваивает число копий фрагмента-мишени, т. е. количество продукта (амплификата) в процессе ПЦР растет в геометрической прогрессии: 25-35 циклов реакции позволяют получить далее из единичного фрагмента ДНК достаточное количество амплификата для даль­нейшего изучения. В течение нескольких часов с помощью ПЦР из одного фрагмента молекулы ДНК можно получить более 50 млрд. идентичных молекул. Таким образом, можно изучить гене­тический материал, присутствующий в изучаемом образце в ми­нимальных количествах.

Теоретически метод ПЦР позволяет обнаружить даже одну копию ДНК в образце, не имея, таким образом, предела чувстви­тельности. Еще одно преимущество ПЦР заключается в том, что для этого метода характерна не только абсолютная чувствитель­ность, но и абсолютная специфичность. ПЦР не дает ложноположительных результатов при условии, что метод используется правильно. ПЦР-метод является не заменой традиционных мор­фологических, биохимических или иммунологических методик, но их существенным и необходимым дополнением.

В настоящее время в практическое здравоохранение внедряет­ся новая технология ПЦР - ПЦР в реальном времени (Real-TimePCR). Ее особенностями являются мониторинг и количественный анализ накопления продуктов полимеразной цепной реакции, а также автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов. Этот метод не требует стадии электрофореза, что позволяет снизить требования, предъявляемые к ПЦР - лаборатории. За счет экономии производственных площадей, уменьшения количества персонала и востребованности количест­венного определения ДНК/РНК этот метод в последние годы ус­пешно применяется в крупнейших санитарно-эпидемических, диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира, замещая ПЦР в ее сегодняшнем («классическом») формате.

ПЦР в реальном времени использует флюоресцентномеченые олигонуклеотидные зонды для детекции ДНК в процессе ее ам­плификации. ПЦР в реальном времени позволяет провести пол­ный анализ пробы в течение 20-60 мин и теоретически способен детектировать даже одну молекулу ДНК или РНК в пробе.

ПЦР в реальном времени использует систему TaqMan контро­лирующую кинетику ПЦР непосредственно в ходе амплификации с использованием резонансного тушения флюоресценции. Для детекции используются зонд, несущий флюорофор и тушитель, комплементарный средней части амплифицируемого фрагмента. Когда флюорофор и тушитель связаны с олигонуклеотидным зондом, наблюдается лишь незначительная флюоресцентная эмиссия. В процессе амплификации за счет 5'-экзонуклеазной активности Taq-полимеразы флюоресцентная метка переходит в раствор, освобождаясь от соседства с тушителем, и генерирует флюоресцентный сигнал, усиливающийся в реальном времени пропорционально накоплению амплификата.

На сегодняшний день в теории и практике ПЦР накоплен бо­гатый опыт. Однако наряду с успехами, связанными с внедрени­ем ПЦР в клинико-диагностических лабораториях, нередко имеет место недоверие к этому методу из-за ошибок, приводящих к некорректным результатам. В основном такие ошибки возникают из-за контаминации ампликонами, которые попадают в окружающую среду на этапе детекции при переносе из пробирки в гель или планшет для гибридизационного анализа.

В связи с этим большой интерес прелставляют модификации метода ПЦР, по­зволяющие учитывать результаты реакции, не открывая пробир­ки. Одним из таких вариантов является метод «FLASH» (FLuorescentAmplification-basedSpecificHybridization) - специ­фическая флюоресцентная гибридизация в процессе амплифика­ции.

В основе метода «FLASH» лежат три явления:

· эффект гашения флюоресценции;

· 5'-экзонуклеазная активность Taq-полимеразы;

· взаимодействие комплементарных фрагментов ДНК.

Следует отметить, что разработанная фирмой «ДНК"-Технология» система «FLASH» позволяет свести к мини­муму риск контаминации продуктами амплификации. Детекция результатов проводится в закрытых пробирках, что позволяет выполнять ПЦР - исследования в одной комнате и привлекать меньшее количество персонала. Кроме того, регистрация, интер­претация и хранение полученных результатов проводятся авто­матически.

ДНК-экспресс (НПФ «Литех»). Метод основан на термокоагуляционном кондиционировании ДНК. Полнота выделения ДНК из образца близка к 100 %. ДНК практически полностью остается в растворе, так как отсутствует разделение и перенос фаз. Наличие слизи, гноя, крови и прочих посторонних включе­ний практически не влияет на результат пробоподготовки. В слу­чае ингибирования ПЦР проба может быть подвергнута повтор­ной обработке без взятия материала у пациента. Защита от пере­крестной контаминации «от пробы к пробе» и возможной контаминации ампликонами достигается за счет того, что про­бирка в процессе обработки ни разу не открывается, в нее не до­бавляются посторонние компоненты. Пробоподготовка проходит в три стадии: вортексирование, нагрев, центрифугирование. При наличии одного термостата на 24 ячейки и одной центрифуги на 12 ячеек обработка 24 проб занимает всего 20 мин.

К преимуществам метода относятся простая и быстрая пробоподготовка, минимальный риск кросс-контаминации. Недостат­ком является достаточно ограниченный спектр биологического материала, пригодного для использования. Метод ДНК-экспресс предназначен для работы со следующим материалом: соскобы эпителиальных клеток, слюна, осадок мочи, сперма, секрет пред­стательной железы, спинномозговая жидкость, синовиальная жидкость. Однако ограниченная по времени сохранность материала является еще одним недостатком.

Уникальные диагностические возможности ИФА и ПЦР сде­лали их наиболее распространенным и в то же время постоянно развивающимися лабораторными методами в диагностике ин­фекций во всем мире. Однако их практическое применение тре­бует от врача определенного уровня знаний по иммунологии, молекулярной биологии и микробиологии. Так, при диагностике хронических, персистирующих инфекций, передаваемых поло­вым путем (ИППП) необходим комплексный подход - сочетание анализов на антитела сыворотки крови и локальных соскобов на ПЦР или антиген. Применение только соскобов допустимо лишь при остром или подостром воспалениях, но и тогда имеется риск получить ложноотрицательные результаты излеченности.

ПЦР выявляет самую стабильную, консервативную моле­кулу микроорганизмов - ДНК. Именно в уникальной последо­вательности нуклеотидов ДНК зашифрована наследственная ин­формация всех живых существ (геном некоторых вирусов содер­жит РНК). Специфичность ПЦР близка к 100 %, но в клинической практике ее чувствительность могут ограничивать некоторые факторы, поэтому исследователь может иногда полу­чить ложноотрицательные результаты. Прежде всего, отметим, что при хроническом воспалительном процессе макроорганизм ограничивает очаг воспаления клеточным барьером, а также кон­тролирует выход возбудителей постоянно циркулирующими IgG и IgA. При технически недоступной локализации очага для зонда-пробоотборника результат ПЦР будет ложноотрицательным. Также следует указать на целесообразность применения провока­ции перед использованием ПЦР. Обнаружение положительных результатов ПЦР в крови указывает на активизацию инфекции, вплоть до генерализации.

Дата добавления: 2014-12-25