Преимущества методов молекулярной клинической диагностики

ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

Метод ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени предусма­тривает автоматическую регистрацию увеличения флюоресцентного сигнала, пропорционального количеству синтезированных в ходе реакции специфических фрагментов ДНК (микроорганизмов, человека, животных и т.д.).

Реакция выполняется и автоматически регистрируется специализированными приборами для осуществления ПЦР в режиме реального времени. Программное обеспечение оборудования может автоматически переводить полученные данные в удобный для чтения врача-лаборанта формат.

В зависимости от исходной концентрации специфических нуклеиновых кислот (микроорганизмов, человека и т.д.) в исследуемом образце переход из стадии инициации в экспоненциальную стадию происходит на разных циклах. Чем больше в образце искомой ДНК, тем на более раннем цикле прибор начнет регистрировать флюоресценцию; чем меньше искомой ДНК, тем на более позднем цикле начнется автоматическая регистрация флюоресценции.

Метод ПЦР с детекцией результатов в процессе амплификации предоставля­ет возможность количественно оценивать ДНК микроорганизмов в исходном материале, а также использовать мультиплексный анализ (анализ результатов по нескольким каналам детекции), что дает возможность выявлять большее количе­ство микроорганизмов в каждой пробирке.

Основным преимуществом метода ПЦР при диагностике инфекционных аген­тов по сравнению с классическими микробиологическими методами (культивиро­ванием и идентификацией клинических изолятов) является быстрота исполнения (5-6 ч). В сравнении с иммунологическими определениями (например, иммуноферментными или иммунофлюоресцентными методами выявления антигенов).

ПЦР во многих случаях является более чувствительным и экономичным методом (по крайней мере, на отечественном рынке соответствующих реагентов). В частности, при диагностике вирусных инфекций, особенно гепатита С, вирусную РНК в плазме больных обнаруживают с первых дней заболевания, тогда как спе­цифические антитела (основной объект иммунологического скрининга при гепа­тите С) -только спустя 2-7 нед после заражения. При диагностике папилломы молекулярно-биологические методы позволяют дифференцировать онкогенные и менее патогенные типы вируса, а также идентифицировать вирус, интегрирован­ный в хромосомы человека, т.е. предраковые состояния.

При идентификации генетических заболеваний (инактивации белка из-за генной мутации) ДНК-диагностика стала более практичным методом выявления больных и членов семей - носителей мутантного гена по сравнению с биохими­ческими методами определения соответствующих метаболитов. Молекулярно-биологические методы особенно важны для диагностики наследственных заболева­ний, для которых неизвестен четкий биохимический субстрат или соответствующая биохимическая диагностика весьма дорога. Прогресс генной диагностики связан с успешным завершением проекта «Геном человека», в результате которого стала известна нормальная последовательность нуклеотидов в 99,9% генов человека. При подозрении на наличие редких мутаций гена проводят амплификацию и последующее секвенирование выделенного сегмента. Медико-генетические иссле­дования касаются в первую очередь наиболее распространенных генетических заболеваний - муковисцидоза, фенилкетонурии, миодистрофий.

При выявлении онкогенов, специфичных для различных злокачественных заболеваний, особенно лейкозов и лимфом, ПЦР-диагностика (при необходи­мости с последующим секвенированием продукта ПЦР) становится методом диагностики, превосходящим иммунохимические способы диагностики (иммуно-гистологические, проточно-флюориметрические) по чувствительности и часто по экономичности исследования.

Приборы для количественного учета пцр в режиме реального времени -(REAL-TIME PCR)

Приборы для оценки ПЦР в режиме реального времени представляют собой своеобразный гибрид амплификатора и флюориметра и позволяют оценивать динамику ПЦР прямо в закрытых пробирках по мере накопления продукта ампли­фикации и проводить количественный ПЦР-анализ. Специфичность сигнала при ПЦР в реальном времени обусловлена применением специальных ДНК-зондов с флюоресцентной меткой. В процессе ПЦР по мере синтеза новых и новых копий искомого участка гена происходят специфическое связывание этой меченой цепочки нуклеотидов и ее разрушение с выходом красителя в окружающую среду. По мере протекания ПЦР светочувствительные элементы снимают показатели с каждой из пробирок и вводят эти данные в память компьютера. При этом строится динамическая кривая накопления ПЦР-продукта по отдельным пробам.

Объемы анализируемых проб, время анализа и температура измерений соот­ветствуют таковым для обычной ПЦР. Тем не менее в этом режиме не требуется дополнительное время на процедуры, связанные с электрофорезом, так как кри­вые накопления продуктов реакции доступны сразу по окончании real-time PCR. Калибровка зависит от типа имеющегося прибора. Она требуется для оптимизации параметров оптического блока и выравнивания показателей по отдельным лун­кам, осуществляется с теми флюорохромами, которыми помечены применяемые ДНК-зонды.

Количественная оценка ДНК или РНК патогенного микроорганизма в кли­нических образцах бывает исключительно важна для прогноза заболевания и контроля терапии. Эта технология активно внедряется в российские клинико-диагностические лаборатории.

Кроме возможности количественного учета результатов реакции, к несо­мненным достоинствам real-timePCR следует отнести высокую технологичность исследования и снижение вероятности загрязнения помещений лаборатории про­дуктами амплификации

Методы молекулярной клинической диагностики при скрининге (массовых обследованиях)

Уникальным преимуществом молекулярно-биологических методов является возможность динамического наблюдения за присутствием и содержанием опре­деленных генов, что позволило ввести их в соответствующие диагностические панели. Основным требованием на скрининговом этапе исследований является высокая чувствительность при достаточной специфичности диагностики. В част­ности, сочетанное применение иммунологических методов и ДНК-диагностики позволяет проводить серийные обследования на наличие гепатитов В, С и ВИЧ-1 в особых группах риска. На следующем этапе возможно повторное проведение диагностики уточняющего характера в отобранных во время скрининга группах с сомнительными или положительными результатами.

Дата добавления: 2014-12-25