МЕТОДИЧЕСКИе указания к лабораторным занятиям

ТЕМА 1. ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВЕЖЕСТИ МЯСА С ПОМОЩЬЮ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ (4 ч.)

Вопросы и задания для самостоятельной внеаудиторной

подготовки.

1. Какие методы определения свежести мяса Вы знаете?

2. Охарактеризуйте органолептические показатели свежего и несвежего мяса.

3. Какие группы микроорганизмов влияют на качество мяса и мясопродуктов?

4. Каковы правила отбора проб для определения свежести мяса?

Литература:(2, конспект лекций).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.Освоить методики микробиологического исследования при оценке свежести мяса.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Мясо здорового скота можно считать практически свободным от микроорганизмов. Мясо павших больных и переутомлённых животных содержит аэробные и анаэробные микроорганизмы.

Бактерии, попавшие на поверхность мяса, постепенно проникают вглубь него. Скорость проникновения зависит от температуры окружающей среды и вида микроорганизмов. В мясо, охлаждённое до 2-4º С, бактерии проникают через 30 дней в середину на глубину 1 см. Проникновению микроорганизмов препятствует образующаяся в результате подсыхания мяса корочка. При хорошей корочке туша может храниться при 00С около 8 недель.

После убоя скота происходят изменения в мышечной ткани, наступает период созревания мяса, характеризующийся сложными физико-химическими процессами. При распаде гликогена в мышечной ткани накапливается молочная кислота, а в результате распада АТФ – фосфорная кислота. Для завершения созревания мяса требуется обычно несколько дней.

Если мясо хранить при температурах, благоприятных для развития микроорганизмов, в нём начнутся микробиологические процессы. Преобладающей микрофлорой в гниющем мясе становятся гнилостные палочки. Примерно через 3-4 сут в глубине мяса начинают размножаться и анаэробы (Clostridium perfringens, Cl. sporogenes и др.). Даже в мясе клинически здоровых животных иногда обнаруживают болезнетворные микроорганизмы, которые вызывают мясные отравления (пищевые токсикоинфекции). Часть их содержится в кишечнике животных и в момент убоя.

В случае убоя животных, больных сибирской язвой, туберкулезом, бруцеллезом, рожей свиней и другими инфекционными заболеваниями, возбудители обязательно содержатся в мясе. Условия убоя, использование и выбраковка мяса больных животных регулируются особыми ветеринарными правилами.

По степени свежести мясо подразделяют на доброкачественное, мясо сомнительной свежести и мясо, непригодное в пищу.

Доброкачественное мясо имеет сухую корочку бледно-розового или бледно-красного цвета. На разрезе оно плотное, эластичное, ямка после надавливания быстро исчезает.

Несвежее мясо покрыто плотной тёмно-красной или ослизненной корочкой. Консистенция его мягкая, несколько дряблая, образующаяся при надавливании пальцем ямка не заполняется. Запах неприятный, гнилостный. Такое мясо используют только по указанию ветеринарно-санитарного надзора.

Если поверхность испорченного мяса ослизнённая, липкая, на разрезе оно зелёного цвета, консистенция мяса дряблая, мажущаяся, жир слизистый, с прогорклым запахом, то его бракуют, это непригодное в пищу мясо.

Порядок выполнения работы

Для анализа берут 2 сорта мяса: свежее и несвежее. На предметных стёклах делают по два мазка-отпечатка: один – с поверхностного, другой – из глубинного слоя каждого сорта. Для приготовления препарата-отпечатка из поверхностного слоя мяса стерильными ножницами вырезают кусочек (0,5–1 г) и прикладывают его срезанной стороной к поверхности обезжиренного, фламбированного предметного стекла. Чтобы приготовить препараты-отпечатки из глубоких слоёв, поверхность мяса прижигают нагретым шпателем, стерильным ножом делают надрез и берут из глубины небольшой кусочек (0,5–1 г), который прикладывают к стеклу. Препараты подсушивают на воздухе, фиксируют над пламенем спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют, подсчитывая количество микроорганизмов в каждом поле зрения и отмечая их форму.

Препарат отпечаток свежего мяса окрашивается обычно плохо. Если он получен из поверхностного слоя мяса, то в поле зрения встречаются единичные (до 10 клеток) кокки и палочки, нет следов распада мышечной ткани. В препаратах из глубоких слоёв микроорганизмы или отсутствуют, или встречаются не во всех полях зрения.

Препарат отпечаток мяса сомнительной свежести окрашивается удовлетворительно. При просмотре в каждом поле зрения обнаруживается по нескольку десятков микроорганизмов (не более 30 кокков или палочек), особенно в препарате из поверхностного слоя мяса. Также заметны следы распада мышечной ткани: ядра мышечных волокон в состоянии распада, слабо различимая исчерченность волокон.

Мясо считают несвежим, если в мазках-отпечатках как из поверхностных, так и из глубинных слоёв мяса в поле зрения обнаруживается свыше 30 бактерий с преобладанием палочек. Также отмечается значительный распад тканей: почти полное исчезновение ядер и полное исчезновение исчерченности мышечных волокон. Препарат-отпечаток окрашивается хорошо.

При разложении мяса кокки в отпечатках почти отсутствуют и всё поле зрения усеяно палочками. Среди гнилостных микроорганизмов преобладают микрококки, кишечная палочка, флуоресцирующие бактерии, споровые формы.

Из аэробных бактерий наиболее активно ведут гнилостный процесс спорообразующие палочки - сенная (Bacillus subtilis) и грибовидная (Bacillus mycoides). Из факультативно-анаэробных – палочка протея обыкновенного (Proteus vulgaris). Из анаэробных - спорообразующие палочка путрификус (Clostridium putrificus) и палочка спорогенес (Clostridium sporogenes).

Для выявления анаэробов поверхность мяса двух сортов (свежее и несвежее) прижигают нагретым шпателем, стерильным ножом делают надрез и берут из глубины по небольшому кусочку. Соблюдая правила асептики, опускают их в пробирки с расплавленным и предварительно охлаждённым до 50ºС МПА. Вращая пробирки между ладонями, следят, чтобы кусочки мяса осели на дно пробирок.

Опытные пробирки с МПА, содержащие свежее и несвежее мясо, помещают в термостат при 40ºС. После инкубирования посевов в термостате в течение нескольких дней пробирки просматривают визуально.

Если мясо несвежее, на МПА развиваются газообразующие анаэробные формы и в среде обнаруживаются разрывы агара в результате выделения микроорганизмами газа.

В пробирках со свежим мясом столбик МПА будет плотным, не содержащим разрывов и трещин, так как газообразующие анаэробные формы в нём не развиваются.

Контрольные вопросы и задания:

1. От чего зависит скорость проникновения микроорганизмов вглубь мясной туши?

2. На чём основывается микроскопический анализ при определении свежести мяса?

3.Какие микроорганизмы преобладают в гниющем мясе?

ТЕМА 2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ОТДЕЛЬНЫХ ВИДОВ И ГРУПП МИКРОБОВ (8 ч)

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Освоить практические методы определения микробных контаминантов в мясе на основе бактериологического анализа.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Вследствие высокого содержания влаги и белков мясо здоровых животных является благоприятной средой для развития микрофлоры, вызывающей гнилостную порчу. В обычных условиях убоя стерильного мяса не бывает, в нём идентифицируются все группы микроорганизмов: бактерии, микромицеты, лучистые грибки, дрожжи и вирусы.

Санитарное состояние мяса и его устойчивость к гнилостному разложению зависят от соблюдения санитарно-гигиенических требований при выращивании и заготовке скота, транспортировании, первичной переработке и производстве мясных продуктов. У истощённых и утомлённых животных понижается устойчивость организма, и бактерии из кишечника и лимфоузлов проникают в кровь и ткани. В этом случае в мясе обнаруживают кишечную палочку, палочку протея, стафилококки и анаэробные палочки. При различных заболеваниях животных и птицы мышцы и внутренние органы нередко обсеменены микроорганизмами. Продукты убоя этих животных (птицы) могут вызвать у человека инфекционные заболевания или пищевые отравления.

Обсеменение мяса микроорганизмов может происходить и в процессе переработки скота: при съёмке шкуры, извлечении внутренних органов, обескровливании, зачистке, шпарке, а также при использовании грязного инструмента, низком уровне личной гигиены работников.

С целью предотвращения микробной кросс-контаминации мяса в процессе переработки рекомендуется делать акцент на выявление потенциально опасного пищевого сырья и ингредиентов, которые могут содержать токсические вещества, патогенные бактерии или большое количество микроорганизмов, вызывающих порчу продуктов; обнаружение вдоль всей технологической цепи источников и конкретных точек, где может возникнуть контаминация продукта; предотвращение условий, при которых возможны выживание и рост микроорганизмов.

Учитывая скоропортящийся характер сырья и благоприятные естественные условия развития микрофлоры в мясе, контроль общей микробной обсеменённости и определение наличия патогенных бактерий и бактериальных токсинов являются обязательным этапом исследования сырья и готовой продукции.

Бактериологический анализ проводят в следующих случаях:

При подозрении на остропротекающие инфекционные заболевания, обнаружении в мышцах единичных некротических очагов, наличии патологических изменений в мышцах туши и во внутренних органах; при поражении отдельных лимфатических узлов или органов, нескольких органов и удовлетворительной упитанности туши; при мыте; при беломышечной болезни и кетозах; при маститах, эндометритах, параметритах коров и овец; во всех случаях вынужденного убоя животных независимо от причин убоя и принадлежности животных; при отравлении или подозрении на отравление ядовитыми веществами химического или растительного происхождения; при подозрении на сальмонеллёз; при желудочно-кишечных заболеваниях; при заболеваниях органов дыхания; при обширных ожогах, кровоизлияниях в подкожной клетчатке, во внутренних органах, на слизистых оболочках; при отёках внутренних органов и частей туши; при жировом перерождении печени; при наличии гнойных очагов в печени, почках, селезёнке и лёгких; при желтушном окрашивании всех тканей туши, исчезающем в течении двух суток; при сомнительной свежести мяса или других продуктов и невозможности установить их доброкачественность органолептическим путём и в других случаях.

Кроме указанных случаев бактериологическое исследование мяса может проводиться также по требованию ветеринарного или медико-санитарного надзора.

Параллельно с бактериологическим анализом в лаборатории проводят биохимические, органолептические и физико-химические исследования. Это позволяет сделать более обоснованное заключение о предубойном состоянии животного и порядке реализации продуктов убоя.

Исследование мяса и мясопродуктов на наличие микроорганизмов основано на бактериоскопии мазков-отпечатков из глубоких слоёв образцов и посеве на простые и элективные (избирательные) среды и среды обогащения. В зависимости от результатов бактериоскопии и характера роста на питательных средах проводят исследования на наличие определённых микробов.

План исследований, проводимых студентами на занятии по бактериологическому исследованию мяса, предусматривает:

изучение характера роста бактерий на мясопептонном агаре. Цветным карандашом по донышку чашки студенты обводят несколько колоний, готовят из них мазки, окрашивают по Граму, микроскопируют;

определение обшей бактериальной обсеменённости мяса по числу колоний, выросших на мясопептонном агаре;

изучение характера роста бактерий на среде Эндо или других элективных средах. Студенты обводят цветным карандашом несколько колоний, похожих по внешнему виду на колонии бактерий сальмонеллёзной группы;

подсчёт колоний на среде Эндо;

приготовление мазков из подозрительных колоний на среде Эндо, окрашивание по Граму, определение морфологии бактерий;

исследование бактерий из подозрительных колоний на подвижность;

высев микробов из подозрительных колоний на пёстрый ряд, в 2-3 пробирки на скошенный агар и в 2-3 пробирки со средой для определения образования индола.

Подготовка проб. Отбор проб для анализа ведут в соответствии с действующей нормативной документацией в производственных условиях. При анализе в учебной лаборатории в образцах мяса устанавливают патологоанатомические и органолептические характеристики. После этого проводят бактериоскопию мазков-отпечатков из глубоких слоёв и посев на простые и элективные (избирательные) среды и среды обогащения.

Для этого каждый образец перед посевом освобождают от видимых жировой и соединительной тканей, погружают на 2-3 мин в этанол и два раза обжигают с поверхности. Затем стерильными ножницами из глубины различных мест каждого образца вырезают кусочки размером не менее 2,0×1,5×2,5 см; лимфатические узлы разрезают пополам. Затем все вырезанные кусочки измельчают стерильными ножницами.

ВЫЯВЛЕНИЕ БАЦИЛЛ СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ (4 ч)

Вопросы для самостоятельной внеаудиторной подготовки

1. Какие инфекционные болезни называют зооантропонозами?

2. Какие мероприятия проводят на мясокомбинатах при обнаружении сибирской язвы?

3. С помощью каких методов осуществляют дифференциальную диагностику сибиреязвенной палочки от гнилостных аэробных бацилл?

Литература: (2, 3, конспект лекций)

Пояснения к занятию.

Сущность метода заключается в определении характерной морфологии и характера роста на питательных средах.

Бациллы сибирской язвы неподвижны, в организме образуют капсулы, а во внешней среде при доступе кислорода и температуре 12-42 ºС – споры. При микроскопировании мазков из патологического материала обнаруживают крупные грамположительные палочки, соединённые в короткие цепочки; иногда цепочки имеют форму бамбуковой трости.

При окраске раствором сафранина массовой долей 2 % сибиреязвенные бациллы окрашиваются в кирпично-красный цвет, а капсулы и тени (следы распада бактерий) – в светло-жёлтый.

При окраске по методу Ребигера бациллы антракса окрашиваются в тёмно-фиолетовый цвет, а капсулы – в красно-фиолетовый.

На МПА через 18-24 ч бациллы растут в виде серо-белых, шероховатых, с бахромчатыми краями колоний, напоминающих при осмотре через лупу головку медузы или львиную гриву. Из подозрительной колонии делают посев в пробирку с МПБ.

На МПБ сибиреязвенные бациллы растут в виде крупных хлопьев, оседающих на дно пробирки к концу первых суток, сообразованием осадка, напоминающего комок ваты. Бульон остаётся прозрачным. Из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная», или «висячая», капля. При микроскопировании препарата под средним увеличением микроскопа обнаруживают неподвижные сибиреязвенные палочки.

Порядок выполнения работы.

При анализе в учебной лаборатории в образцах мяса устанавливают патологоанатомические и органолептические характеристики. После этого делают 2 мазка-отпечатка на предметных стеклах из глубоких слоёв исследуемого куска мяса. Один из препаратов сушат на воздухе, фиксируют и окрашивают водным раствором сафранина массовой долей 2 % в течение 1-3 мин (лучше при нагревании), затем быстро промывают водой, высушивают фильтровальной бумагой (окраска капсул по методу Ольта).

При окраске капсул по методу Ребигера мазки окрашивают и фиксируют одновременно. Нефиксированные мазки окрашивают раствором генцианвиолета в течение 15-20 с, быстро промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.

Второй мазок-отпечаток окрашивают по Граму.

После этого производят посев кусочка пробы размером не менее 2,0×1,5×2,5 см путём нанесения отпечатков разными сторонами пробы на поверхность предварительно подсушенного в чашке Петри мясо-пептонного агара. Посевы помещают в термостат при температуре 37 ºС. Через 18-24 ч чашки извлекают из термостата и просматривают визуально, при необходимости – через лупу или под малым увеличением микроскопа. При отсутствии роста через 18 ч посевы выдерживают в термостате дополнительно ещё 6 ч.

На мясо-пептонном агаре отыскивают колонии, характерные для сибирской язвы и делают из них посев в пробирку с МПБ, а также красят по Граму мазок, приготовленный из подозрительной колонии.

Через сутки из бульонной культуры готовят препарат «раздавленная», или «висячая», капля.

В результате анализа подтверждают или опровергают диагноз – сибирская язва

Контрольные вопросы

1. Какими отличительными особенностями обладает возбудитель сибирской язвы?

2. Что является основанием для подтверждения диагноза сибирской язвы?

ВЫЯВЛЕНИЕ СТАФИЛОКОККОВ (4 ч)

Вопросы для самостоятельной внеаудиторной подготовки

1. Какова характеристика пищевого отравления, вызванного энтеротоксигенными стафилококками?

2. Как широко распространены стафилококки в природе? Обитают ли они в организме человека и животных?

3. Каким образом происходит перенос стафилококков от людей на пищевые продукты?

Литература: (2, 3, конспект лекций)

Пояснения к занятию.

Сущность метода заключается в определении морфологии, характера роста на питательных средах и способности отдельных стафилококков коагулировать цитратную плазму крови кролика под воздействием фермента коагулазы.

На питательных средах стафилококки образуют различные по цвету пигменты. Золотистый стафилококк (Staph. aureus) может образовывать золотистый, белый, жёлтый и оранжевый пигменты. Эпидермальный стафилококк (Staph. epidermidis) на мясопептонном агаре формирует колонии белого и жёлтого цвета, сапрофитный стафилококк (Staph. saprophyticus) образует белый и жёлтый пигмент. Стафилококки – факультативные анаэробы шаровидной формы, располагаются в виде гроздевидных скоплений, иногда встречаются единичные клетки или короткие цепочки кокков. Они не имеют капсул и жгутиков, не образуют спор, хорошо растут на обычных питательных средах, окрашивание по Граму даёт положительную реакцию.

Золотистый стафилококк обладает патогенными свойствами и продуцирует энтеротоксины.

Порядок выполнения работы

Кусочком мяса, взятым стерильно из глубины пробы, делают мазки (отпечатки) прикосновением к поверхности мясопептонного агара, налитого в чашки Петри. Посевы помещают в термостат при температуте 37 ºС на 24 часа. Колонии стафилококков круглые, выпуклые, сочные, величиной 2-4 мм, они бывают белого, оранжевого, лимонно-жёлтого и золотисто-жёлтого цвета. Подозрительные колонии отсевают на скошенный агар, из полученных чистых культур делают мазки и окрашивают по Граму.

Дифференциальный диагноз ставят на основании микроскопического исследования (грамположительные, неподвижные, неспорообразующие, круглые клетки, располагающиеся кучками, напоминающими виноградные гроздья), а также определения характера роста на питательных средах.

На мясопептонном бульоне стафилококки дают равномерное помутнение с выпадением обильного осадка.

Патогенные стафилококки по своим ферментативным свойствам отличаются от сапрофитных и условно-патогенных. На мясопептонной желатине, при посеве уколом, патогенные стафилококки дают кратерообразное разжижение среды. Молоко они свёртывают, а затем пептонизируют.

Для установления патогенности стафилококков ставят реакцию коагулирования плазмы крови.

Контрольные вопросы

1. Какой вид стафилококков является патогенным? Как дифференцировать этот вид от других?

2. Какова морфология стафилококков?

3. На основании чего осуществляют дифференциальный диагноз стафилококков от других бактерий?

ТЕМА 3. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ КОЛБАСНЫХ ИЗДЕЛИЙ И ПРОДУКТОВ ИЗ МЯСА (6 часов)

Вопросы для самостоятельной внеаудиторной подготовки

1. Какие источники обсеменения колбасных изделий микрофлорой Вы знаете?

2. Как изменяется состав микрофлоры в процессе выработки варёных и копчёных колбасных изделий?

3. Каково влияние остаточной микрофлоры на качество колбасных изделий при хранении?

Литература: (2, 3, конспект лекций).

ЦЕЛЬ РАБОТЫ. Приобрести практический навык в анализе микробных контаминантов колбасных изделий и продуктов кулинарной готовности на основе бактериологического анализа.

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ. Обсеменение колбасных изделий микрофлорой происходит в основном через сырьё, оборудование, инвентарь, тару и т. п. По количественному и качественному составам микрофлора сырого колбасного фарша разнообразна. Общее количество микроорганизмов в 1 г сырого фарша варёных колбас, например, составляет 0,6×105-1,4×105.

В готовых колбасах или копчёных изделиях не должно быть патогенной и условно-патогенной микрофлоры.

Бактериологический анализ колбасных изделий и продуктов из мяса включает определение: общего количества микроорганизмов; бактерий группы кишечной палочки; бактерий рода Salmonella; бактерий рода Proteus; коагулазоположительных стафилококков; сульфитредуцирующих клостридий - Clostridium perfringens.

Обнаружение кишечной палочки и протея в глубоких слоях продукта указывает на нарушение технологии изготовления и прежде всего температурного режима. Наличие в колбасных изделиях кишечной палочки свидетельствует о неудовлетворительных санитарно-гигиенических условиях технологического процесса и обязывает принять незамедлительные меры по их улучшению.

При наличии кишечной палочки и протея, но при хороших органолептических показателях варёные и полукопчёные колбасы направляют на переработку на низшие сорта с повторной проваркой. Сыровяленые и сырокопчёные изделия в этом случае дополнительно выдерживают 10-12 сут и повторно исследуют в лаборатории на наличие микрофлоры. При отрицательном результате продукцию реализуют без ограничений, при положительном – перерабатывают на варёные виды колбас.

При обнаружении в колбасных изделиях аэробных сапрофитов (B. subtilis, B. mesentericus) или спорообразующих непатогенных анаэробов (B. putrificus, B. sporogenes и др.), но при хороших органолептических показателях продукцию выпускают без ограничений.

Анализ колбасных изделий и продуктов из мяса рекомендуется проводить по следующему плану:

бактериоскопическое исследование колбасных изделий или продуктов из мяса;

посев на среду Эндо для определения бактерий группы кишечной палочки;

посев для учёта общего количества микроорганизмов в 1 г продукта;

посев в конденсационную воду скошенного агара (по Шукевичу) с целью выявления протея.

По истечении времени (24-48 ч) анализ проводят по плану:

изучение характера роста микрофлоры на питательных средах;

подсчёт общей бактериальной обсеменённости продукта;

приготовление мазков из подозрительных колоний с окрашиванием по Граму и микроскопированием;

определение подвижности микроорганизмов;

пересев на одну из сред накопления (Мюллера, Киллиана или Кауфмана);

изучение биохимических и антигенных свойств выросшей культуры и идентификация вида микроорганизма.

Микробиологическое исследование колбасных изделий заключается в приготовлении мазков-отпечатков из поверхностных и глубинных слоёв батона и посеве на питательные среды с последующим изучением полученной культуры и подсчётом количества микробных тел в 1 г продукта.

Порядок выполнения работы

Для бактериоскопического исследования пробы берут непосредственно из-под оболочки и из середины батона. Если колбасное изделие без оболочки, то срезают верхний слой на 1-2 мм. Стерильными ножницами вырезают два кусочка колбасы и прикладывают к поверхности предметного стекла. Подсушивают, фиксируют их над пламенем спиртовки, окрашивают по Граму и микроскопируют. В случае порчи колбас накопление микрофлоры отмечается в мазках-отпечатках из поверхностных слоёв.

Дата добавления: 2015-03-29