Определение коли-титра и коли-индекса

Определение микробного числа.

Микробное число - общая микробная загрязнённость - определяется числом микробных колоний, которые вырастают на простой питательной среде (МПА) при 37 єС в течение 24 ч из посева 1 мл исследуемой пробы воды.

Данный показатель позволяет учитывать не все микроорганизмы, содержащиеся в 1 мл воды, а лишь способные расти на простых средах при указанной температуре (мезофильные, сапрофитные). Однако число сапрофитных микроорганизмов, вырастающих на МПА, обычно соответствует степени загрязнённости воды органическими веществами и, таким образом, косвенно характеризует её санитарное состояние.

Для определения микробного числа делают посевы с соблюдением правил асептики в чашки Петри с МПА методом заливки с таким расчётом, чтобы на чашках вырастало от 30 до 300 колоний. Поэтому из проб артезианской и водопроводной воды (содержащей обычно меньше микроорганизмов) высевают соответственно объёмы в 1 мл и 0,1 мл из неразведённых проб. При исследовании воды открытых водоёмов высевают по 1 мл из предварительно приготовленных в стерильной воде десятикратных разведений исследуемой пробы (10-1-10-3и более, в зависимости от предполагаемого загрязнения).

Указанные выше объёмы проб воды (1 мл, 0,1 мл) или её разведений (по 1 мл каждого) вносят стерильной пипеткой в пустые стерильные чашки Петри, в которые затем наливают расплавленный тёплый МПА (температура не выше 45-46 єС). Воду и МПА тщательно перемешивают и после застывания среды посевы выращивают в термостате при 37 єС в течение 24 ч. Затем подсчитывают микробные колонии.

Общее число микробных колоний, выросших на всей чашке Петри, умножают на разведения, из которых был сделан высев 1 мл (чтобы перевести на 1 мл исследуемой воды). Затем определяют среднее арифметическое число колоний – микробное число исследуемой пробы.

Кишечная палочка является постоянным обитателем толстого отдела кишечника человека и всех теплокровных животных. Она выделяется во внешнюю среду с фекальными массами, поэтому используется как индикатор фекального загрязнения внешней среды и косвенный показатель наличия в воде болезнетворных микробов - возбудителей кишечных инфекций человека, выделяемых с фекалиями в воду и другие объекты.

Таким образом, кишечная палочка служит санитарно-показательным микроорганизмом воды. Поскольку она не образует спор и гибнет при относительно щадящих методах обеззараживания, её присутствие в консервированных продуктах или воде указывает на нарушение режима консервирования и на недостаточность обработки воды, так как если кишечная палочка сохранила жизнеспособность, значит, могли выжить и другие неспорообразующие бактерии, такие, как дизентерийная шигелла, брюшнотифозная сальмонелла и другие патогенные бактерии – возбудители желудочно-кишечных заболеваний.

Коли-индекс (индекс кишечной палочки) – это число кишечных палочек, обнаруженных в 1 л исследуемой воды.

Коли-титр – это наименьший объём (в мл) или масса (в г) исследуемого материала, в котором обнаруживается хотя бы одна клетка кишечной палочки.

По существующим нормативам коли-титр питьевой воды не должен быть менее 333 мл, а коли-индекс – не более 3.

Коли-титр определяют методом бродильных проб. Он основан на способности кишечной палочки теплокровных животных и человека развиваться при повышенных температурах (43-44 єС) и сбраживать сахара (манит, глюкозу и др.) с выделением газа.

Определение проводят в три этапа. На первом этапе ставят первую бродильную пробу: различные разведения исследуемой воды при помощи стерильных пипеток вносят в колбы и пробирки со специальными углеводными жидкими средами (среда Булира, среда Эйкмана, розоловая и др.) и поплавками.

В зависимости от предполагаемого микробного загрязнения водоисточника применяют разные схемы посева. Так, при исследовании водопроводной воды делают посевы в общем объёме 300 мл (2 объёма по 100 мл и 10 объёмов по 10 мл). При исследовании воды открытых водоёмов (речной, озёрной и т. д.) необходимо посеять воду в общем объёме 111,1 мл (1 объём - 100 мл; 1 объём - 10 мл и по одному объёму в 1 мл и 0,1 мл).

Соотношение между средой и засеваемой водой должно быть 1: 2. Поэтому посевы малых количеств воды (1 мл, 0,1 мл) выполняют в пробирки с разведённой средой (обычной концентрации), а большие объёмы воды (100 мл; 10 мл) – в концентрированную среду.

Посевы выращивают в термостате при 43-44 єС в течение 24 ч. При указанной температуре подавляется развитие микроорганизмов, не имеющих санитарно-показательного значения для воды. Затем просматривают посевы для выявления признаков роста кишечной палочки (наличие пузырьков газа в поплавках, изменение цвета, помутнение).

На втором этапе для подтверждения правильности обнаружения роста кишечной палочки в жидкой среде из посева с признаками роста при помощи бактериальной петли делают высев в чашки Петри со средой Эндо и выращивают культуру при 37 єС 24 ч.

Среда Эндо состоит из МПА, лактозы и обесцвеченного индикатора (фуксин обесцвечен сульфитом натрия). На данной среде бактерии группы кишечной палочки теплокровных животных образуют типичные тёмно-красные, ярко-красные или розовые колонии с тёмным центром, имеющие металлический блеск или без него. Столь характерный рост на среде Эндо этих бактерий обусловлен тем, что они активно сбраживают лактозу, продукты расщепления которой вызывают восстановление индикатора фуксина, окрашивающего колонии. При отсутствии характерного роста на пробу дают отрицательный ответ.

При наличии типичных колоний из них делают мазки, которые окрашивают по Граму и микроскопируют. Если в мазках обнаруживают мелкие неспорообразующие грамотрицательные палочки, то переходят к третьему этапу для окончательного подтверждения результатов исследования.

На третьем этапе из типичных колоний, в которых при микроскопировании обнаружены характерные микробные клетки, делают пересев в разведённую жидкую углеводную среду (Булира, Эйкмана и др.). Посевы выращивают при 43-44 єС в течение24 ч, после чего учитывают окончательно. При наличии в посевах помутнения, газообразования и изменения цвета дают положительный ответ, результаты которого выражают в виде коли-титра. При отсутствии газообразования даётся отрицательный ответ, т. е. данные первой бродильной пробы подтверждаются.

Коли-индекс определяют методом мембранных фильтров. Для этой цели используют мембранные фильтры № 3 (ультрафильтры) – пористые плёнки, изготовленные из микроклетчатки (нитроцеллюлозы), с диаметром пор 0,7 мкм. Перед фильтрацией их подвергают стерилизации двойным кипячением в дистиллированной воде в течение 15-20 мин. Затем стерильным пинцетом фильтры помещают на предварительно профламбированную поверхность фильтровального прибора Зейтца. Через фильтр Зейтца проводят фильтрацию под вакуумом определённого количества исследуемой воды (через один мембранный фильтр – не более 100 мл воды).

По окончании фильтрации освобождают фильтровальную пластинку, частично разбирая прибор. При помощи стерильного пинцета фильтр кладут осадком вверх на поверхность среды Эндо, залитой в чашку Петри, плотно прижимая к среде. В одну чашку можно поместить 4-5 фильтров. После культивирования в термостате при 37 єС в течение 18-24 ч подсчитывают выросшие на фильтре колонии, характерные для группы кишечной палочки. Из 2-3 колоний, типично окрашенных и бесцветных, берут материал для мазков, окрашивают их по Граму и микроскопируют с иммерсионным объективом.

Если в мазках присутствуют мелкие грамотрицательные неспорообразующие палочки, из оставшейся части колонии делают пересев в пробирки с небольшим объёмом жидкой углеводной среды (среда Булира и др.). Посевы выращивают при 43-44 єС в течение24 ч. Наличие газообразования – последний показатель присутствия бактерий группы кишечной палочки.

Контрольные вопросы

1. Какие показатели определяют при санитарно-микробиологическом исследовании воды?

2. В связи с чем кишечная палочка служит санитарно-показательным микроорганизмом воды?

3. Этапы определения коли-титра.

Дата добавления: 2015-03-29